基于網絡藥理學和分子對接分析豆根管食通口服液治療食管癌的分子機制*

鄺玉慧，陳欣菊，徐方飚，陳曉琦，鄭玉玲

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000

食管癌(esophageal cancer，EC)是惡性程度較高的一類腫瘤，具有易復發和遠距離轉移的特性，病死率居世界惡性腫瘤第6位[1]。食管癌分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocacinoma，EAC)兩個類型，在中國，ESCC是最常見的類型[2]。EC早期發現比較困難，通常發現時已是晚期。目前，治療EC以手術、放療、化療、靶向治療、熱療等多學科診療模式(multiple disciplinary team，MDT)為核心，但由于EC較易發生腫瘤的浸潤、轉移和復發，其五年的生存期仍然低于25%[3]。中醫認為，“痰瘀互結”是EC重要的病因病機。鄭玉玲教授同樣重點強調“痰”和“瘀”在食管癌發生發展中的作用，認為食管癌的發病機制多以正氣虧虛為本，痰氣瘀毒為標，尤以痰瘀為主，證屬本虛標實[4]。研究表明，中醫藥配合放化療有增敏減毒的作用，可提高患者生活質量，其機制可能為增強機體免疫功能、誘導癌細胞凋亡、調節腫瘤微環境[3，5-6]。

鄭玉玲教授在多年食管癌治療的基礎上，擬定以“化痰祛瘀”為治則，具有化痰理氣、活瘀散結、止痛抗癌的中藥復方——豆根管食通口服液。豆根管食通口服液由山豆根、沉香、黃藥子、急性子、制天南星、姜半夏、三七、郁金等8味中藥口服液組成。山豆根為君藥，具有散結消腫、清熱解毒、利咽的功效；制天南星溫化頑痰，黃藥子解毒散結消瘀，急性子軟堅消瘀，姜半夏化痰散結降逆，沉香降逆行氣，郁金止痛活血，共為臣藥；三七化瘀理氣為佐使藥。上述諸藥合用，共奏解毒散結、化痰祛瘀之功，適用于痰氣交阻、瘀血內結及痰瘀互結等證型的食管癌患者。豆根管食通口服液可降低患者血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)及血清腫瘤標志物唾液酸(sialic acid，SA)的水平，明顯提高患者血清干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)和血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、IgG、IgM的水平，提高患者免疫功能，縮小或穩定腫瘤病灶，提高患者生活質量，延長患者生存期，改善患者預后[7-9]；抑制Eca-109細胞的增殖，促進Eca-109細胞凋亡及食管癌模型大鼠的癌細胞凋亡[10-12]。

目前，豆根管食通口服液治療EC的作用機制尚未完全闡明。本研究借助網絡藥理學和分子對接技術，分析豆根管食通口服液治療EC的作用機制，為臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 豆根管食通口服液活性成分的收集與篩選根據2015年版《中華人民共和國藥典》規范豆根管食通口服液中8味中藥的名稱，采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，檢索豆根管食通口服液組方中藥的化學成分，以口服生物采用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為標準，對所有化學成分進行篩選，搜集活性化學成分，建立藥物活性化學成分數據集。

1.2 豆根管食通口服液組成藥物活性成分相關靶點搜集采用TCMSP檢索豆根管食通口服液組方中藥活性成分的相關靶點，使用Uniprot數據庫中UniProKB(https：//www.uniprot.org/)檢索功能，輸入靶蛋白名稱，限定物種為“Homo sapiens”，剔除非人源靶點，將查詢得到的所有蛋白名稱轉化為基因ID，建立活性成分靶點數據庫。

1.3 EC靶點搜集采用人類孟德爾遺傳在線數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)[13]、疾病關聯數據庫(genetic association database，GAD，https：//geneticassociationdb.nih.gov/)、人類基因數據庫(the human gene database，GeneCards，https：//www.genecards.org/，v4.12.0 Build 31)[14]，限制物種為“homo sapiens”，以“esophageal cancer”為關鍵詞進行檢索，搜集與EC相關的靶點，建立數據庫。

1.4 “藥物-疾病”交集靶點篩選及豆根管食通口服液治療EC有效活性成分篩選將EC靶點數據庫與活性成分相關靶點數據庫進行映射，交集靶點即為豆根管食通口服液治療EC的有效靶點，將有效靶點與活性分相關靶點進行比對，刪除活性成分非交集靶點對應的添生成分即為豆根食通口服液治療EC的有效活性成分。

1.5 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建將藥物、有效活性成分及交集靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，并繪制“藥物-有效活性成分-靶點”網絡圖。

1.6 豆根管食通治療EC的關鍵靶點及分析STRING數據庫可通過文獻等數據支撐，提供蛋白質之間相互作用證據。MCC(maximal clique centrality)算法是一種基于密度的非交疊式聚類算法，以種子節點為中心進行擴展，在其鄰居節點中尋找滿足要求的節點[15]，能更好地預測互作網絡中的關鍵蛋白。將豆根管食通口服液治療EC的有效靶點導入STRING數據庫進行蛋白質相互作用(protein protein interaction，PPI)分析，限制物種為“homo sapiens”。將得到PPI網絡導入Cytoscape，通過關鍵節點分析工具Cytohubba的MCC、度(degree)、中介中心度(betweeness)及鄰近中心度(closeness)4種網絡拓撲分析的關鍵特征參數[16]，分別計算前出30個核心靶點，取相同靶點為關鍵靶點。

1.7 關鍵靶點富集分析采用DAVID數據庫對關鍵靶點進行基因本體(gene discovery，GO)生物功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析，其中GO生物功能富集分析包含三大類，分別是生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。限定物種為“homo sapiens”，設定標準為P≤0.05，Q≤0.05，根據通路富集結果，導入Cytoscape軟件進行可視化分析。

1.8 分子對接驗證分子對接以受體理論為基礎，通過計算機虛擬模擬，評價藥物活性成分與關鍵靶點的結合能力。本研究采用AutoDock軟件進行分子對接驗證，并采用Pymol軟件去除氫原子及配體，并將對接結果可視化，以此評價豆根管食通口服液有效活性化合物與靶蛋白之間的結合活性，并根據其結合能大小篩選出豆根管食通口服液治療EC的潛在核心化合物。

2 結果

2.1 豆根管食通口服液活性成分的獲取及相關作用靶點的搜集通過檢索TCMSP數據庫，并以OB≥30%、DL≥0.18為標準篩選得到豆根管食通口服液的活性成分97種，其中山豆根21種、沉香9種、急性子9種、黃藥子15種、姜半夏13種、三七8種、制天南星7種、郁金15種。通過TCMSP數據庫獲取豆根管食通口服液有效活性成分相關靶點128個。見表1。

表1 豆根管食通口服液中各中藥OB值前5位的活性成分信息表

2.2 豆根管食通口服液治療EC的有效靶點及有效活性成分的篩選采用OMIM、GAD及GeneCards數據庫檢索并搜集與EC疾病相關靶點6 095個。將97種豆根管食通口服液活性成分的128個相關靶點與6 095個EC疾病相關靶點進行映射，得到106個相同靶點，即為豆根管食通口服液治療EC的有效靶點。將106個豆根管食通口服液治療EC的有效靶點與128個活性成分的相關靶點進行對比，刪除22個非有效靶點對應的活性成分，即為豆根管食通口服液治療EC的有效活性成分，共59種，其中山豆根16種、沉香9種、急性子8種、黃藥子14種、姜半夏13種、三七7種、制天南星6種、郁金2種。

2.3 “藥物-有效活性成分-靶點”網絡構建將8味中藥對應的有效活性成分及豆根管食通口服液有效活性成分治療EC的有效靶點導入Cytoscape軟件進行映射，構建“藥物-有效活性成分-靶點”，見圖1。

圖1 豆根管食通口服液治療EC的“藥物-有效活性成分-靶點”網絡

2.4 PPI網絡分析結果將豆根管食通口服液有效活性成分治療EC的有效靶點導入STRING數據庫，獲取PPI網絡，并將PPI網絡導入Cytoscape軟件，通過Cytohubba插件進行4種算法分析，分別篩選出前30位靶點，并繪制4種算法Veen圖，得到21個交集靶點，即為關鍵靶點，分別是MAPK3、IL-6、EGF、CAT、JUN、EGFR、PTGS2、AR、VEGFA、ESR1、IL-1β、PPARG、MAPK1、MAPK8、HSP90AA1、CYCS、MMP1、MTOR、IL-2、CCL2、HMOX1，見圖2、圖3。

圖2 蛋白互作網絡圖

圖3 Cytohubba 4種算法篩選出關鍵靶點的Veen圖

2.5 GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析采用DAVID數據庫對關鍵靶點進行GO生物功能和KEGG信號通路富集分析，以P≤0.05，Q≤0.05為標準篩選后得到GO生物功能條目1 476條，KEGG信號通路107條。1 476條GO生物功能包括1 314條生物學過程、59條分子功能及26條細胞組分，其中生物學過程主要涉及DNA結合轉錄因子活性的調節、細胞對氧化應激的反應等；分子功能主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)活性、生長因子活性等；細胞組分主要涉及囊泡腔、膜區等。107條KEGG信號通路主要涉及白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信號通路、輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)細胞分化、缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路等。將差異顯著的前20條通路導入Cytoscape軟件，構建“通路-靶點”網絡，靶點參與所富集的通路越多，則該靶點所代表的三角形形狀越大；通路所含靶點越多則該通路所代表的菱形形狀越大，見圖4、圖5、圖6，表2。

表2 差異顯著的前20名通路富集結果

圖4 GO生物功能富集分析氣泡圖

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖6 “通路-靶點”網絡圖

2.6 分子對接驗證分析根據數據結果及文獻支持，選取在“藥物-有效活性成分-靶點”網絡中度值最高的3種成分：即β-谷甾醇(β-sitosterol)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)，采用計算機模擬與通路中度值較高的兩個關鍵靶點MAPK3、EGFR進行分子對接驗證。成分結構來源于Pubchem數據庫，靶點蛋白結構來源于PDB(protein data bank)數據庫，采用Pymol去除氫原子及配體后并將對接結果可視化，導入AutoDock進行對接模擬，結合能小于-7 kcal·mol-1則認為該結合具有較高的結合能力，結合能值越低則表示結合越穩定。結果顯示，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、MAPK3與3個化合物的結合能均小于-7 kcal·mol-1，說明化合物均能與EGFR、MAPK3結合。見圖7，表3。

圖7 分子對接結果

表3 分子對接結果

3 討論

中醫認為，人是一個整體，治療疾病時要系統全面，從多角度、多方面出發起到緩解病癥、延緩疾病進展的作用。網絡藥理學研究是采用整合的中藥活性成分及相關靶點數據庫與信息分析技術，從整體出發，系統挖掘潛在的中藥治療疾病的作用機制，與中醫的整體觀念相契合。本課題組采用網絡藥理學和分子對接技術，系統而全面地挖掘豆根管食通口服液治療EC的潛在作用機制。

本研究篩選出豆根管食通口服液治療EC的活性成分共59種，其中山豆根16種、沉香9種、急性子8種、黃藥子14種、姜半夏13種、三七7種、制天南星6種、郁金2種。從活性成分種類數目來看，符合山豆根為君藥，而制天南星、急性子、黃藥子、姜半夏、郁金及沉香共為臣藥的君臣關系。本研究發現，度值前3位的成分分別為槲皮素、β-谷甾醇與山柰酚，表明這3個化合物可能是豆根管食通口服液治療食管癌的關鍵成分。β-谷甾醇為半夏、沉香、天南星、急性子、黃藥子、三七和郁金等7味中藥的活性成分，是一種植物甾醇，具有降低血脂、抗癌和抗炎的作用[17-18]。Zhu等[19]研究發現，β-谷甾醇可提高機體免疫力，并參與調節腫瘤細胞的生長和凋亡信號轉導路徑，從而影響腫瘤細胞的生長。槲皮素是沉香、黃藥子、急性子、三七、山豆根的活性成分，是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物。研究顯示，槲皮素可抑制胃癌、肝癌等多種腫瘤細胞的生長、遷移，抑制血管生成，誘導腫瘤細胞凋亡、壞死和自噬[20]。誘導癌細胞凋亡是槲皮素發揮抗癌作用的重要方式，可激活死亡受體途徑或線粒體信號轉導途徑，誘導癌細胞凋亡[21]。此外，槲皮素亦具有增敏和減輕放化療不良反應的作用[22]。山柰酚是急性子、黃藥子、山豆根的活性成分，可通過線粒體途徑抑制人食管癌Eca-109細胞的增殖，并誘導細胞凋亡[23]，在胃癌細胞中亦能抑制細胞生長并且誘導細胞凋亡[24-25]。山柰酚還可通過激活宿主免疫力，抑制腫瘤血管生長并增加其他抗癌藥物的敏感性來發揮抗癌作用[26]。

本研究共篩選出豆根管食通口服液治療EC的關鍵靶點21個，大致分為蛋白激酶、激素及其受體、過氧化氫酶、熱激蛋白和轉錄因子等。MAPK是一種激活絲氨酸-蘇氨酸磷酸化的蛋白激酶，在細胞增殖、生長及凋亡中發揮重要作用。目前，已經鑒定出的MAPK途徑有許多，其中細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)途徑中的ERK1，亦稱為MAPK3，是本研究的核心靶點。研究表明，抑制ERK1即MAPK3的活性，細胞增殖將受到明顯抑制[27-28]。分子對接結果顯示，MAPK3與槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚均能較好地結合，提示豆根管食通口服液的有效成分可能參與調節MAPK3的表達，從而起到抑制腫瘤細胞增殖的作用。

EGFR是一類屬于表皮生長因子受體家族的跨膜受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)，可啟動多種細胞內信號通路，促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡、侵襲、轉移[29]。其中血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是參與內皮細胞增殖、分化和遷移的促血管生成因子之一。MAPK、ERK和PI3K-Akt信號通路是將細胞外信號傳遞到細胞核內最重要的信號通路，在調控細胞增殖、血管生成和代謝等中發揮關鍵作用。研究表明，裸鼠瘤體微血管密度顯著降低，VEGF表達降低，腫瘤內血管新生的形成明顯抑制[30]。本課題組前期基礎研究發現，豆根管食通口服液可抑制VEGF的表達[31]。分子對接結果顯示，EGFR與槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚均能較好的結合，提示豆根管食通口服液的有效成分可能參與到EGFR的調節，從而達到抑制腫瘤細胞內血管新生的作用。通路富集發現，TNF通路有顯著差異，而本課題組前期基礎研究發現其可提高患者血清中 IL-6 與IL-10水平，提高機體免疫力[32]，其中 IL-6 本次研究的關鍵靶點。以此可以初步推斷本次網絡藥理學研究是成功的，具有一定的代表性。

綜上所述，豆根管食通口服液可以通過多成分、多靶點及多途徑的方式發揮治療EC的作用，為進一步探討其治療EC的作用機制提供了科學依據，也為中藥復方抗EC的物質基礎和作用機制提供了重要的科學依據。