基于NF-κB/COX-2信號通路探討芍藥內酯苷對潰瘍性結腸炎模型大鼠的影響*

黃梅，顏景穎

1.南方科技大學醫院，廣東 深圳 550002；2.北京中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳 518111

潰瘍性結腸炎是一種腸道非特異性慢性炎癥性疾病，主要表現為腹瀉、腹痛、便血等并伴隨著消瘦、發熱等癥狀[1]。我國潰瘍性結腸炎的發病率逐年上升[2]。由于潰瘍性結腸炎易反復發作，久治難愈，甚至需終生服藥的特點，使患者生活質量嚴重下降。潰瘍性結腸炎常用治療藥物有氨基水楊酸制劑、抗生素、免疫抑制劑等，由于部分患者服用此類藥物仍存在病情反復發作，不易控制等情況[3]。因此，尋找新的藥物尤為重要。芍藥內酯苷是白芍提取物之一，具有抗菌消炎、護肝等作用。研究表明，芍藥湯對大鼠潰瘍性結腸炎有一定的藥效作用[4]。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)/環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)信號通路在腸道炎癥過程中發揮重要作用[5]。因此，本研究旨在分析芍藥內酯苷通過調控NF-κB/COX-2信號通路對潰瘍性結腸炎模型大鼠的影響，為芍藥內酯苷的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物60只8周齡SPF級SD雄鼠，體質量210～230 g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2018-0006，溫度 22～25 ℃，相對濕度40%～60%，光照和黑暗各12 h，自由進食標準飼料和飲水。倫理批號：SUSTH20190302。

1.2 藥物與試劑芍藥內酯苷(純度≥98%，南京道斯夫生物科技有限公司，批號：190412)；美沙拉嗪腸溶片(德國?？酥扑幑煞萦邢薰荆枺篐201207)。三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitro-Benzenesulfonic acid，TNBS)溶液(美國Sigma公司，批號：1904182)；白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(武漢云克隆診斷試劑研究所有限公司，批號：R201905、R201903)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(上?？ㄅ锟萍加邢薰?，批號：190410A)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號：201906C)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(上海康朗生物科技有限公司，批號：201904136、201902115)；實時定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)熒光染料預混劑(北京康為世紀生物科技有限公司，貨號：PCR106321)；蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色試劑盒(上海羽朵生物科技有限公司，批號：190407004)；引物合成委托北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；NF-κB、COX-2、p-NF-κB、β-actin兔單克隆抗體和山羊抗兔辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗(美國Abcam公司，批號：201905148、201906037、201906024、201907235、201908241)。

1.3 儀器H2100R型高速冷凍離心機(上海湘儀離心機儀器有限公司)；Evolution350型紫外分光光度計(美國Thermo公司)；HTY-761型勻漿儀(浙江泰林生物技術股份有限公司)；LightCycler 96型 RT-qPCR儀(瑞士羅氏公司)；Tetra Cell制膠系統、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；LAUDA型搖床(德國Varioshake公司)；BIOBASE-EL10A型酶標儀(山東博科生物產業有限公司)；XSP-19C型光學顯微鏡(上海上光儀器有限公司)；YGQ-3126F型切片機、YT-7F型攤烤片機(孝感市亞光醫用電子技術有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備與給藥60只SD雄鼠，隨機選取10只為假手術組，其余大鼠使用TNBS/乙醇混合液灌腸法建立潰瘍性結腸炎模型，具體如下：大鼠禁食不禁水 24 h，TNBS(80 mg·kg-1)與體積分數50%無水乙醇按11混合。將大鼠麻醉后，使用硅膠軟管(直徑2 mm)插入大鼠肛門約8 cm深度，將 800 μL TNBS/乙醇混合液推入腸腔，倒置大鼠30 s，防止混合液外漏，待自然清醒后，正常飼養。假手術組大鼠麻醉后向腸腔內注射800 μL生理鹽水。3 d后，隨機挑取3只建模大鼠，取結腸組織經過HE染色觀察結腸病變，出現出血、水腫、潰瘍即為建模成功。將建模成功的大鼠隨機分為5組，即模型組、美沙拉嗪組(0.36 g·kg-1)、芍藥內酯苷高劑量組(60 mg·kg-1)、芍藥內酯苷中劑量組(30 mg·kg-1)、芍藥內酯苷低劑量組(15 mg·kg-1)，各組給予相應藥物14 d；假手術組和模型組均灌胃同體積生理鹽水，每日1次，連續14 d。在造模期間死亡1只大鼠，然后分為假手術組10只、模型組9只、美沙拉嗪組9只、芍藥內酯苷高劑量組10只、芍藥內酯苷中劑量組9只，芍藥內酯苷低劑量組9只。

2.2 ELISA法檢測大鼠血清促炎因子水平給藥結束后，將大鼠麻醉，輔助動脈取血，室溫靜置2 h，3 000×g離心20 min，取上層清液即為血清，通過ELISA試劑盒檢測大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平。

2.3 檢測大鼠結腸組織抗氧化指標取血后，將大鼠頸椎脫臼法處死后，取出結腸，每只取同部位少許結腸，加生理鹽水，制備結腸組織勻漿。硫代巴比妥酸反應法檢測大鼠結腸組織中MDA活性；黃嘌呤氧化酶法檢測大鼠結腸組織中SOD活性。

2.4 HE染色觀察大鼠結腸組織病變每組隨機選取3只大鼠，取結腸組織置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定過夜后，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，經過脫蠟、復水后按照HE染色試劑盒說明書進行切片HE染色，在顯微鏡下觀察其病理損傷變化。

2.5 RT-qPCR法檢測大鼠結腸組織NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平每組隨機選取3只大鼠，取結腸組織，加入液氮研磨勻漿后，用RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，然后再用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。NF-κB上游引物：5′-TAAGCATCGATTCCAGTAGAC-3′，下游引物：5′-TGATGCCATGCACTACGATA-3′，產物長度121 bp；COX-2上游引物：5′-CAGCTAGCCACATGATTCAC-3′，下游引物：5′-ATCTACAGATTCAGGATCGAT-3′，產物長度137 bp；β-actin上游引物：ATCTGACCGATACAGCATACG-3′，下游引物：5′-CTAGCTAGGCTAGCCCATAGA-3′，產物長度115 bp。設置反應程序：解鏈溫度95 ℃ 30 s，退火溫度56 ℃ 30 s，延伸溫度72 ℃ 30 s，35個循環。使用配套熒光采集系統分析各樣本Ct值，計算出目的基因mRNA的相對表達量。

2.6 Western Blot法檢測大鼠結腸組織NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表達每組隨機3只大鼠，取結腸組織，加入適量液氮研磨勻漿后，加入細胞裂解液，4 ℃裂解過夜后，10 000×g離心 10 min，上清即為組織總蛋白，將蛋白上樣、電泳、轉膜后，加入體積分數5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜，TBST緩沖液洗3次，更換二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，顯色。使用圖像分析軟件對條帶灰度值進行分析，并以β-actin為內參計算出目的蛋白表達量。

3 結果

3.1 芍藥內酯苷對大鼠血清促炎因子水平的影響與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，芍藥內酯苷高劑量組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平極顯著降低(P<0.01)，芍藥內酯苷中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較

3.2 芍藥內酯苷對大鼠結腸抗氧化指標活性的影響與假手術組比較，模型組大鼠結腸組織MDA活性顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，芍藥內酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結腸組織MDA活性顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠結腸MDA、SOD活性比較

3.3 芍藥內酯苷對大鼠結腸組織病理學變化的影響假手術組大鼠結腸各層結構清晰，腺體排列整齊，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠結腸黏膜多處潰爛、壞死，腺體排列紊亂，炎性細胞浸潤嚴重；芍藥內酯苷高劑量組結腸黏膜結構基本完整，腺體排列整齊，少量炎性細胞浸潤；美沙拉嗪組和芍藥內酯苷中劑量組大鼠結腸黏膜上皮較完整，腺體排列較整齊，有少量炎性浸潤；芍藥內酯苷低劑量組大鼠結腸黏膜充血水腫偶見潰瘍，腺體排列稀疏且不規整，炎性細胞浸潤減輕。見圖1。

3.4 芍藥內酯苷對大鼠結腸組織NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平的影響與假手術組比較，模型組大鼠結腸組織NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芍藥內酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠大鼠結腸組織NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠結腸組織NF-κB mRNA、COX-2 mRNA表達比較

3.5 芍藥內酯苷對大鼠結腸組織NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠結腸組織p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芍藥內酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結腸組織p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 大鼠結腸組織NF-κB、COX-2蛋白及p-NF-κB表達

表4 各組大鼠結腸組織NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表達比較

4 討論

潰瘍性結腸炎的發病機制尚未明確，遺傳、免疫低下、腸道微生態失衡等均是其致病因素[6-7]。多種因素相互作用引起機體免疫反應被激活，炎性因子釋放，造成腸道發生持續性炎癥，嚴重影響腸道的功能，損壞腸道黏膜屏障[8-9]，使得細胞通透性增加，導致腸黏膜遭受細菌、內毒素等侵害，發生糜爛、潰瘍等[10]。中醫學認為，潰瘍性結腸炎主要由大腸濕熱、肝血虧虛所致，治療以補虛瀉實、清熱利濕、理氣導滯為主[11-12]。芍藥具有清熱涼血、補血柔肝、散瘀止痛等功效[13-14]，芍藥內酯苷是其主要的有效成分之一，研究芍藥內酯苷對潰瘍性結腸炎的治療效果具有重要臨床意義。

IL-1β是引起潰瘍性結腸炎的促炎因子之一，可促使炎性細胞進入炎癥部位，活化淋巴細胞等作用[15]。研究表明，潰瘍性結腸炎患者在潰瘍活動期結腸中IL-1β水平升高[16]。IL-1β已作為臨床判斷潰瘍結腸炎的潰瘍程度與療效的重要指標之一。TNF-α是一種重要的促炎因子，已證實與潰瘍性結腸癌發病有關[17]。正常生理狀態下，TNF-α具有抗感染、促進組織修復等作用，在病理狀態下，會刺激機體局部組織發生炎癥反應[18-19]。研究報道，TNF-α可改變腸道黏膜通透性，導致腸道損傷，且隨著腸道損傷程度加重，TNF-α水平也隨之升高[20]。本研究結果顯示，與模型組比較，芍藥內酯苷組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平顯著降低，提示芍藥內酯苷可以抑制炎癥反應。

研究表明，潰瘍性結腸炎局部炎癥反應與氧自由基密切相關，機體氧自由基可激活或者充當炎性介質，引起結腸組織發生炎癥反應[21]。研究發現，發生氧化應激時，氧自由基可與不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，脂質過氧化產物可被機體代謝分解為MDA，MDA可使組織中蛋白質變性、生物膜結構受損，引起促炎因子釋放，導致組織損傷加重[22]。SOD為抗氧化酶，可清除氧自由基，抑制組織中脂質過氧化反應。研究表明，潰瘍性結腸炎患者血清、腸黏膜中MDA升高而SOD降低[23]。本研究結果發現，與模型組比較，芍藥內酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結腸組織MDA活性顯著降低，SOD活性顯著升高。

NF-κB通路與炎癥反應關系密切，當機體發生炎性反應時，促炎因子IL-1β、TNF-α等可激活NF-κB，使其發生磷酸化，激活 NF-κB 通路，促使IL-1β、TNF-α的進一步表達，發生炎癥反應[24-26]。研究表明，潰瘍性結腸炎結腸病變組織NF-κB異常高表達[27]。COX-2在正常組織中表達極低，在炎癥、腫瘤等病理狀態下其表達顯著增加[28]。COX-2可使炎癥細胞產生大量前列腺素E2、白三烯等炎癥介導物質，導致炎癥部位出現紅、腫、熱、痛，從而加重腸道潰瘍[29-30]。本研究結果顯示，模型組比較，芍藥內酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結腸組織p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表達顯著降低，提示芍藥內酯苷對潰瘍性結腸炎的治療作用可能與NF-κB/COX-2信號通路有關。

綜上所述，芍藥內酯苷可抑制潰瘍性結腸炎大鼠的炎癥反應，抑制結腸組織過氧化反應，減輕結腸組織病變，作用可能與NF-κB/COX-2信號通路有關。