縮泉潤(rùn)腸方對(duì)便秘模型大鼠結(jié)腸組織中水通道蛋白的影響*

潘姣，張曉雨，孫光軍，2，林愛珍，2

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061

便秘是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，一般表現(xiàn)為排便困難或排便次數(shù)減少、糞便質(zhì)地干硬或伴有排便不盡感[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)成人慢性便秘的患病率為4%～10%[2]，以中老年女性為主。由于本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病程持久的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。其中刺激性瀉藥會(huì)損害腸道神經(jīng)，滲透性瀉藥容易引起電解質(zhì)代謝紊亂，甚至發(fā)生心血管等不良事件[3]。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類具有高度選擇性的跨膜通道[4]，主要用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間水流的作用[5]。結(jié)腸上皮細(xì)胞AQPs表達(dá)的失調(diào)是便秘的發(fā)生的重要因素，Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)證實(shí)糞便含水量與AQPs表達(dá)之間存在顯著相關(guān)性[6]。近年來，中醫(yī)藥治療便秘具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，湖北省中醫(yī)院林愛珍教授以《溫病條辨》中增液湯為基礎(chǔ)自擬驗(yàn)方縮泉潤(rùn)腸方臨床治療老年功能性便秘療效顯著[7-9]，為證實(shí)該驗(yàn)方的通便作用與水通道蛋白的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)擬從結(jié)腸黏膜水通道蛋白AQP3、AQP8、AQP9進(jìn)一步探討縮泉潤(rùn)腸方治療老年性便秘的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物24月齡SPF級(jí)SD大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量(280±20)g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，合格證號(hào)：SCXK-(鄂)2008-0005。所有大鼠單籠單只獨(dú)立飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持21～25 ℃、相對(duì)濕度保持45%～60%，每10 h通風(fēng)換氣1次，24 h 自由飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理實(shí)驗(yàn)委員會(huì)和國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用法批準(zhǔn)。倫理批號(hào)：SYXK2019-0002。

1.2 藥物及試劑縮泉潤(rùn)腸方(顆粒劑)：山藥、益智仁、生白術(shù)、玄參各20 g，火麻仁、當(dāng)歸各15 g，麥冬、烏藥、生地各12 g，杏仁10 g等10味中藥對(duì)應(yīng)生藥量的三九散裝免煎顆粒(湖北省中醫(yī)院藥學(xué)部)；乳果糖口服溶液(Abbott Healthcare Products B.V.進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20120387)；復(fù)方地芬諾酯片(河南鼎昌藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H22022037)；阿拉伯樹膠(泰安市利達(dá)膠業(yè)有限公司,貨號(hào)：ZY-1033)；蘇木素—伊紅染色液(北京索來寶生物科技有限公司,貨號(hào)：G1120)；RNA提取液Trizol(美國(guó)Invitrogen公司,貨號(hào)：15596026)；cDNA Synthesis試劑盒(美國(guó)Fermentas公司,貨號(hào)：K1622)；2×Taq PCR MasterMix試劑盒(北京天根生化科技有限公司,貨號(hào)：KT201)；50×TAB電泳液(北京索來寶生物科技有限公司,貨號(hào)：T1060)；瓊脂糖(西班牙Biowest Agarose公司,貨號(hào)：111860)；DEPC水(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)：46-000)。

1.3 儀器研缽(鄭州華豐化學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)有限公司，規(guī)格：60 mm)；高速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司，型號(hào)：OTC350)；高速冷凍離心機(jī)(上海楚泊實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，型號(hào)：3K15型)；PCR儀(上海比朗儀器有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：MA-1610)；移液器(瑞士HamiIton公司，型號(hào)：Softgrip)；電泳槽(南京瓦森生物科技有限公司，型號(hào)：RF602型)；電泳儀(上海俊仕生物科技有限公司，型號(hào)：SE-300)；鼓風(fēng)干燥箱(天津市美特斯試驗(yàn)機(jī)廠，型號(hào)：101型)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司，型號(hào)：Quintix65-1CN)。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模、分組與給藥采用復(fù)方地芬諾酯混懸液(100 mg·kg-1)連續(xù)灌胃3周建立大鼠便秘模型[10]。將造模成功的大鼠隨機(jī)分模型組、乳果糖口服液組(0.670 g·kg-1)、縮泉潤(rùn)腸顆粒劑低劑量組(14.04 g·kg-1)、縮泉潤(rùn)腸顆粒劑高劑量組(28.08 g·kg-1)，每組10只，另設(shè)10只空白對(duì)照組大鼠，連續(xù)給予相應(yīng)的藥物2周。觀察模型組與空白對(duì)照組大鼠的糞便含水量及碳墨推進(jìn)率判斷造模是否成功。按照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[11]計(jì)算大鼠藥物灌胃劑量。

2.2 標(biāo)本處理大鼠禁食不禁水12 h后，灌胃10%活性炭懸液2 mL，30 min后予以頸椎脫臼處死，將腹部切開，取從直腸末端到幽門之間的全部腸道，測(cè)定碳墨推進(jìn)率。并取升結(jié)腸組織和降結(jié)腸組織各5 cm，予以冰生理鹽水沖洗腸腔內(nèi)容物后，將結(jié)腸切開并用載玻片固定在一端，而用另一載玻片輕輕刮下腸系膜，選取部分組織置于凍存管中，并置于-80 ℃液氮中保存。

2.3 觀察指標(biāo)觀察各組大鼠的一般情況(進(jìn)食量、糞便排出粒數(shù)、毛發(fā)色澤、精神狀態(tài)及處死后結(jié)腸內(nèi)殘留的糞便粒數(shù)等)、糞便含水量、碳墨推進(jìn)率。

糞便含水量=(濕糞質(zhì)量-干糞質(zhì)量)/濕糞質(zhì)量×100%

碳墨推進(jìn)率=[墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度(cm)/小腸總長(zhǎng)度(cm)]×100%

2.4 測(cè)定大鼠結(jié)腸AQP3mRNA、AQP8mRNA、AQP9mRNA表達(dá)采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠結(jié)腸AQP3mRNA、AQP8mRNA、AQP9mRNA表達(dá)[12]：在提取標(biāo)本中的RNA時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行相關(guān)操作，然后在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：每組大鼠各取0.5 g結(jié)腸組織,勻漿,用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL,5×PCR buffer 10 μL,dNTPs 0.5 μL,Tap酶1 μL,cDNA模板5μL,補(bǔ)加雙蒸水至50 μL。擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min,95 ℃ 5 min,95 ℃15 s,60 ℃ 45 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。在NCBI基因庫中檢測(cè)出AQP3、AQP8、AQP9的基因序列，然后通過Primer5.0軟件來設(shè)計(jì)它們的各自引物序列，運(yùn)用并通過NCBI BLAST核對(duì)其特異性是否存在；由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成它們各自引物。引物序列詳見表1。

表1 目的基因的引物核苷酸系列

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況比較模型組大鼠進(jìn)食量及糞便排出粒數(shù)均減少，解剖后發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸組織內(nèi)殘留糞便粒數(shù)增多；乳果糖口服液組及縮泉潤(rùn)腸顆粒組大鼠精神狀態(tài)較模型組有好轉(zhuǎn)，進(jìn)食量及糞便排出粒數(shù)均增加，解剖后發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織內(nèi)殘留糞便粒數(shù)減少。

3.2 大鼠腸管炭墨推進(jìn)率及糞便含水量的變化與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸碳墨推進(jìn)率、糞便含水量顯著降低(P<0.05)，提示便秘大鼠造模復(fù)制成功；與模型組比較，縮泉潤(rùn)腸顆粒低、高劑量組的碳墨推進(jìn)率及糞便含水量顯著增加(P<0.05)，乳果糖口服液組碳墨推進(jìn)率無明顯改善(P>0.05)，糞便含水量顯著升高(P<0.05)；與乳果糖口服液組比較，縮泉潤(rùn)腸顆粒低、高劑量組大鼠結(jié)腸碳墨推進(jìn)率及糞便含水量均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠碳墨推進(jìn)率及大鼠糞便含水量變化

3.3 各組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的變化空白對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜層光滑，腸腺排列整齊，未見潰瘍、糜爛及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠中指狀皺襞的邊緣不致密，表明屏障缺如不完整，且模型組中黏蛋白明顯減少，腸屏障結(jié)構(gòu)受到破壞，結(jié)腸黏膜可見少許上皮脫落，并伴有炎性滲出；乳果糖口服液組大鼠結(jié)腸黏膜較模型組改善明顯；縮泉潤(rùn)腸顆粒組大鼠結(jié)腸炎性滲出減少，腸屏障結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)。見圖1。

注：A：空白對(duì)照組；B 模型組；C 乳果糖口服液組；D：縮泉潤(rùn)腸顆粒低劑量組；E：縮泉潤(rùn)腸顆粒高劑量組

3.4 對(duì)大鼠結(jié)腸組織AQP3mRNA、AQP8mRNA、AQP9mRNA水平的影響與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中AQP3mRNA、AQP8mRNA水平顯著升高，AQP9mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，縮泉潤(rùn)腸顆粒低、高劑量組及乳果糖口服液組大鼠結(jié)腸組織AQP3mRNA、AQP8mRNA水平顯著下降，AQP9mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與乳果糖口服液組比較，縮泉潤(rùn)腸顆粒低、高劑量組大鼠結(jié)腸組織AQP3mRNA、AQP8mRNA水平顯著降低，AQP9mRNA水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸水通道蛋白(AQP3、AQP8、AQP9)mRNA比較

4 討論

《素問·五臟別論》[13]曰：“夫胃大腸小腸三焦膀胱，此五者，天氣之所生也，其氣象天，故瀉而不藏，此受五臟濁氣，名曰傳化之府，此不能久留輸瀉者也。”中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，二便的貯存、排泄與脾、腎、膀胱、大腸密切相關(guān)。脾主運(yùn)化水濕，腎司氣化，大腸傳導(dǎo)糟粕。一般情況下，體內(nèi)多余的水液在脾臟和腎臟等臟腑的參與下由膀胱與大腸進(jìn)行排泄。張仲景提出“利小便實(shí)大便”理論指將大腸中多余水濕之邪通過小便排泄體外，達(dá)到調(diào)節(jié)大便的目的。《傷寒論》第159條記載[14]：“傷寒服湯藥，下利不止，……復(fù)不止者，當(dāng)利其小便。”腸道水分過多，可通過膀胱轉(zhuǎn)輸多余的水液，進(jìn)而排小便散水濕之邪；若脾失健運(yùn)、水濕停滯，則大量水液進(jìn)入膀胱，水液分配失衡以致腸道內(nèi)津液匱乏則易引起大便秘結(jié)不通。由此可知，若腸道水分不足，腸壁干澀失于濡潤(rùn)，可借膀胱之水潤(rùn)滑腸道，助力行舟。故“利小便實(shí)大便”理論可引申出“縮小便通大便”之意，通過固攝膀胱，減少膀胱內(nèi)儲(chǔ)存尿液，傳輸至大腸中改善腸道水生態(tài)微環(huán)境，增加腸道潤(rùn)滑度，協(xié)助排便。

AQPs作為一族特異性孔道，通過介導(dǎo)水液的跨梯度轉(zhuǎn)運(yùn)，控制水分在細(xì)胞的進(jìn)出，在機(jī)體水運(yùn)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。目前結(jié)腸上皮細(xì)胞中AQPs表達(dá)有13種，從AQP0到AQP12，廣泛分布于不同器官和組織的特定細(xì)胞類型中[15]。隨著便秘的研究深入，發(fā)現(xiàn)AQPs中AQP3、AQP8、AQP9參與腸道內(nèi)水液調(diào)控及吸收，與便秘的發(fā)生密切相關(guān)[16-17]。

AQP3主要分布在結(jié)腸黏膜腔面細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞基底側(cè)，是結(jié)腸中水液運(yùn)輸最重要的功能分子之一，可將腸腔內(nèi)的水分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞間隙[18]。AQP3通過影響腸腔內(nèi)水分多少，與便秘的發(fā)生有直接聯(lián)系。此外，AQP3不僅促使結(jié)腸細(xì)胞對(duì)水分的吸收，也可增強(qiáng)其對(duì)尿素和甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。采用復(fù)方地芬諾酯混懸液對(duì)小鼠灌胃進(jìn)行便秘模型的復(fù)制，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠結(jié)腸AQP3蛋白表達(dá)上調(diào)[20]，認(rèn)為便秘與AQP3表達(dá)強(qiáng)弱相關(guān)，而增液湯下調(diào)模型小鼠結(jié)腸AQP3蛋白表達(dá)，“增液行舟”可通過增加腸道內(nèi)水分吸收，從而改善腸腔內(nèi)分泌環(huán)境，促進(jìn)排便。AQP8、AQP9主要表達(dá)于小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞[21]，參與對(duì)糞便水分的吸收及腸道黏液的分泌。其中AQP8在腹瀉患者結(jié)腸中表達(dá)降低，在便秘患者結(jié)腸中表達(dá)明顯升高[22]。研究發(fā)現(xiàn)，朱氏潤(rùn)腸方能直接減少腸道對(duì)水分的重吸收、增加腸液的分泌，其作用機(jī)制可能是與通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，下調(diào)AQP3和AQP8的蛋白表達(dá)，間接增加糞便的含水量，改善慢傳輸型便秘[23]。研究發(fā)現(xiàn)，AQP9在左半結(jié)腸能分泌腸腔黏液，且在左半結(jié)腸的表達(dá)明顯高于右半結(jié)腸，便秘患者左半結(jié)腸AQP9 表達(dá)顯著降低[24]，表明便秘的機(jī)制可能與AQP9的異常表達(dá)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，便秘模型大鼠AQP9表達(dá)在遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中較空白對(duì)照組降低[25]，并證實(shí)AQP9表達(dá)上調(diào)可能與刺激結(jié)腸水分吸收，影響排便。

縮泉潤(rùn)腸方是林愛珍教授三十年來臨證治療老年腎陽虛型便秘的驗(yàn)方。腎陽虛型便秘患者多表現(xiàn)為大便排出困難、糞質(zhì)干硬、平素畏寒、夜尿頻數(shù)。《溫病條辨》：“水不足以行舟，而結(jié)糞不下……”水匱無力行舟故當(dāng)增水助力行舟。該方由山藥、益智仁、生白術(shù)、玄參各20 g，火麻仁、當(dāng)歸各15 g，麥冬、烏藥、生地黃各12 g，杏仁10 g組成。以增液湯為基礎(chǔ)，加以滋陰潤(rùn)腸通便、溫腎固攝之藥組合，通過固腎縮泉、養(yǎng)陰生津，以達(dá)增液潤(rùn)腸、助力行舟之功效[8]。方中益智仁、山藥歸脾、腎經(jīng)，具有溫脾攝涎、暖腎固精縮尿的功效。研究證實(shí)，益智仁中提取的多糖、7-表-香科酮具有改善胃腸功能的作用[26]。生白術(shù)歸脾、胃經(jīng)，功專運(yùn)脾通便。徐靈胎在《傷寒論類方》[27]描述：“白術(shù)生腸胃之津液”。又云白術(shù)“富有膏脂，……亦能滋潤(rùn)津液”。研究證實(shí)，生白術(shù)可通過增加糞便含水量、促進(jìn)腸道傳輸功能，進(jìn)而改善便秘大鼠癥狀[28]。烏藥溫腎散寒，止小便頻數(shù)。火麻仁、當(dāng)歸功專潤(rùn)腸通便，且肺與大腸相表里，佐以杏仁，可增強(qiáng)火麻仁、當(dāng)歸的潤(rùn)滑腸黏膜的作用；玄參、麥冬、生地黃三味中藥合用行“增液行舟”之效。諸藥合用，共奏“補(bǔ)腎縮泉、增液潤(rùn)燥”之功，則腸腑有節(jié)，小便止數(shù)，大便得通。縮泉潤(rùn)腸方的創(chuàng)立乃受先人“利小便實(shí)大便”思想啟發(fā)，反其道而行之，運(yùn)用“縮小便通大便”理念開源助舟、潤(rùn)燥滑腸，治療老年功能性便秘。正如《醫(yī)學(xué)正傳·秘結(jié)論》所言：“夫腎主五液，故腎實(shí)則津液足，而大便滋潤(rùn)，腎虛則津液竭，而大便燥結(jié)”。林師臨證運(yùn)用此法治療老年腎陽虛型便秘效如桴鼓。

綜上所述，縮泉潤(rùn)腸方促進(jìn)便秘大鼠胃腸動(dòng)力和調(diào)節(jié)腸道水液代謝，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)AQP3、AQP8、AQP9表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。從機(jī)體津液分布及代謝角度揭示了中醫(yī)藥治療便秘的機(jī)制，為從“利小便實(shí)大便”角度調(diào)理臟腑功能改善便秘癥狀提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，繼承和發(fā)展了中醫(yī)藥治療老年性便秘的理念。