腦組織中FoxO3在高壓氧暴露后的蛋白表達(dá)

余雪

[摘要] 目的 探討小鼠暴露于高壓氧后其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的反應(yīng)和病理變化、FoxO3蛋白的作用及其機制及FoxO3對急性氧中毒的影響。方法 將體重24～28 g的24只小鼠隨機分為FoxO3蛋白含量測定組和FoxO3 mRNA含量測定組，每組12只。FoxO3蛋白含量測定組的12只小鼠再隨機分為四組，在6個絕對大氣壓條件下暴露30 min，0、8、24 h 分別取大腦皮層;FoxO3 mRNA含量測定組同樣分組;檢測FoxO3蛋白在大腦皮質(zhì)的表達(dá)及定位FoxO3的位置，探討FoxO3起作用的信號、傳導(dǎo)途徑和機制。結(jié)果 在大腦皮層中，Western blot 檢測FoxO3蛋白表達(dá)中，正常組蛋白灰度值比為1.000，暴露結(jié)束后為1.128，結(jié)束后8 h為1.736，結(jié)束后24 h 為1.504，結(jié)果表明結(jié)束后8 h含量達(dá)到峰值;免疫組化檢測大腦皮層FoxO3蛋白胞漿、胞核轉(zhuǎn)位情況中，正常組細(xì)胞核陽性細(xì)胞比例為6%，暴露結(jié)束后為17%，結(jié)束后 8 h為52%，表明暴露結(jié)束后8 h入核現(xiàn)象更加明顯。結(jié)論 FoxO3可以明顯減輕高壓氧引起的急性中毒，以防止氧化應(yīng)激過程中腦組織的傷害。

[關(guān)鍵詞] 高壓氧;急性氧中毒;FoxO3蛋白含量;FoxO3 mRNA含量

[中圖分類號] R363? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）07-0031-02

FoxO3 protein expression in brain tissue after hyperbaric oxygen exposure

YU Xue

International Education College， Nanyang Medical College， Nanyang 473000， China

[Abstract] Objective To investigate the central nervous system reaction and pathological changes of mice exposed to hyperbaric oxygen， the role and mechanism of FoxO3 protein， and the effect of FoxO3 on acute oxygen toxicity. Methods Twenty-four mice with body weight from 24 to 28 g were randomly divided into the FoxO3 protein content determination group and the FoxO3 mRNA content determination group， with 12 mice in each group. Twelve mice in the FoxO3 protein content determination group were randomly divided into 4 groups： in the cerebral cortex of mice exposed to 6 absolute atmospheres （ATA） for 30 minutes were collected at 0h， 8 h and 24 h， respectively. The FoxO3 mRNA content determination group was also divided into groups in this way. The expression of FoxO3 protein in cerebral cortex and the location of FoxO3 were detected to explore the signal， conduction pathway and mechanism of FoxO3 action. Results In the cerebral cortex， with FoxO3 protein expression detected by the Western blot， the gray value ratios of protein were 1.000 in the normal group， 1.128 at 0 h after exposure， 1.736 at 8 h after exposure， and 1.504 at 24 h after exposure， indicating that the content reached the peak at 8 h after exposure. Immunohistochemistry was used to detect the cytoplasmic and nuclear translocation of FoxO3 protein in the cerebral cortex. The proportions of nuclear positive cells were 6% in the normal group， 17% at 0 h after exposure， and 52% at 8 h after exposure， indicating that nucleation was more obvious at 8 h after exposure. Conclusion FoxO3 can significantly reduce the acute toxicity caused by hyperbaric oxygen and prevent the damage of brain tissue during oxidative stress.

[Key words] Hyperbaric oxygen; Acute oxygen toxicity; FoxO3 protein content; FoxO3 mRNA content

大于一個大氣壓的壓力為高壓，高壓氧（hyper-baric oxygen， HBO）治療是將身體置于高壓環(huán)境和呼吸純氧來治療疾病。高壓氧（HBO）現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于許多方面，如潛水作業(yè)和臨床工作。最近有關(guān)船員潛水的調(diào)查表明，快速上升之前呼吸高壓氧（HBO），可以明顯緩解減壓病的發(fā)生。臨床上HBO可改善組織缺氧，促進組織的氧合作用，促進傷口愈合，并在其他生化和細(xì)胞過程發(fā)揮有益作用。高壓氧作為輔助療法治療骨壞死[1]和皮膚皮瓣移植。但是如果吸入過高的氧分壓，有毒反應(yīng)會很快發(fā)生。急性氧中毒的主要臨床表現(xiàn)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system， CNS）的功能障礙，因此，研究其發(fā)病機制，對預(yù)防和治療氧中毒非常有意義[2]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理

24只雄性小鼠，體重24～28 g，隨機分為FoxO3蛋白含量測定組和FoxO3 mRNA含量測定組，每組12只。將FoxO3蛋白含量測定組的12只小鼠再隨機分為四組，每組3只小鼠。正常組：不進行暴露處理;在 6個絕對大氣壓高壓氧條件下暴露 30 min，暴露結(jié)束后0 h（HBO暴露組1）、暴露結(jié)束后8 h（HBO暴露組2）、暴露結(jié)束后24 h（HBO暴露組3）分別取大腦皮層;FoxO3 mRNA含量測定組同樣分組。

1.2 組織中FoxO3蛋白含量的測定

用戊巴比妥麻醉小鼠并處死，取大腦皮層。用裂解緩沖液裂解組織并離心。通過蛋白質(zhì)印跡法取上清液以檢測FoxO3蛋白含量，使用Image J 2X 軟件分析灰度值[3]，每組3只小鼠。

1.3 組織中FoxO3 mRNA含量測定

小鼠暴露結(jié)束后，取大腦皮層。采用戊巴比妥麻醉小鼠并處死，用RT-PCR法檢測腦組織中FoxO3 mRNA含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用 SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;多組之間先進行方差齊性檢驗，后使用F檢驗和LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot 檢測 FoxO3 蛋白表達(dá)

在大腦皮層中，正常組蛋白灰度值比為 1.000，暴露結(jié)束后 0 h 為 1.128，結(jié)束后8 h 為1.736，結(jié)束后24 h為1.504。結(jié)果表明，高壓氧暴露結(jié)束后8 h， FoxO3 α蛋白含量達(dá)到峰值。見表1，封三圖3。

2.2 RT-PCR 檢測 FoxO3 mRNA 表達(dá)

在大腦皮層中，正常組 mRNA 擴增倍數(shù)為1.00，暴露結(jié)束后 8 h為0.85。表明高壓氧暴露結(jié)束后8 h，F(xiàn)oxO3的 mRNA 表達(dá)量變化不明顯。見表2。

2.3 免疫組化法測 FoxO3 胞漿、胞核轉(zhuǎn)位情況

在大腦皮層，正常組胞核陽性比例是6%，暴露結(jié)束后0 h 為17%，結(jié)束后8 h為 52%。結(jié)果表明高壓氧暴露結(jié)束后 8 h，F(xiàn)oxO3入核現(xiàn)象明顯。見表3、封三圖4。

3 討論

高壓氧（HBO）在臨床和潛水中應(yīng)用范圍較廣，但是當(dāng)機體長時間吸入高壓氧時，可導(dǎo)致氧中毒。目前，研究人員對中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧中毒（OT）的發(fā)病機制及其預(yù)防措施的了解還有限。人們普遍認(rèn)為，HBO暴露可導(dǎo)致組織中氧含量的增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過線粒體通過細(xì)胞呼吸將其完全還原為H2O分子的能力。由于存在過量的氧氣，呼吸被過度激活，會產(chǎn)生大量的ROS，引發(fā)一系列強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致OT癥狀。研究表明，F(xiàn)oxO3能結(jié)合啟動子，如FasL基因[4]，P21基因[5-6]，激活 Catalse 基因[7]。

FoxO3既可以誘導(dǎo)又可以保護細(xì)胞凋亡，扮演各種不同細(xì)胞和不同組織氧化應(yīng)激的作用機制[8-10]。當(dāng)氧分壓足夠高（6 ATA）時，F(xiàn)oxO3的核進入和蛋白表達(dá)過程可以在30 min暴露下啟動，表明FoxO3對HBO暴露這種氧化刺激有很高的敏感性，并且確實會積極參與抵消HBO對人體的氧化損傷[11]，進一步證明它與OT有密切的關(guān)系。

經(jīng)高壓氧暴露后，F(xiàn)oxO3 含量升高[12]。HBO暴露結(jié)束后8 h，F(xiàn)oxO3蛋白達(dá)到峰值，蛋白明顯進入核內(nèi)，表明FoxO3可明顯減輕高壓氧引起的急性中毒;以防止氧化應(yīng)激過程中腦組織的傷害[13]，這與Wang等[14]及張亞楠[3]報道的相同。

綜上所述，深入分析FoxO3在氧化應(yīng)激途徑中各個環(huán)節(jié)的作用，對于揭示疾病的發(fā)病機制和尋找有效對策尤為重要。研究證明FoxO3對HBO暴露的氧化刺激具有高響應(yīng)性，這也將幫助醫(yī)務(wù)人員更全面地了解HBO對人體的各種作用，包括其治療作用[15]，均有重要的意義。

[參考文獻]

[1]? ?韋明照，李宏宇.高壓氧治療臨床骨科疾病的應(yīng)用進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2020，36（19）：3111-3114.

[2]? ?劉亞玲，于秋紅，王叢，等.高壓氧與中樞型氧中毒的研究進展[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2019，（8）：631-633.

[3]? ?張亞楠.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FoxO3在高壓氧致急、慢性氧中毒中的作用研究[D].西安：第二軍醫(yī)大學(xué)，2016.

[4]? ?張亞楠，陳保民，高陽，等.FoxO3α轉(zhuǎn)錄因子與機體氧化應(yīng)激損傷的研究進展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2016，29（3）：327-331.

[5]? ?Wang M，Jiang R，Liu JZ，et al. 20（s）ginseonside Rg3 mod-ulation of AMPK/FoxO3 signaling to attenuate mitoch-ondrial dysfunction in a dexamethasone injured C2C12 myotube based model of skeletal atrophy in vitro[J]. Molec-ular Medicine Reports，2021，23（5）：191-194.