探究復配藍莓提取物葉黃素制劑的急性及長期毒性

王玉瑩，甘 露，王榮昌

（江蘇天美健大自然生物工程有限公司，江蘇 南京 210046）

藍莓又名篤斯越橘（Vaccnium uliginosum），屬杜鵑花科（Ericaceae）、越橘屬（Vaccinium）植物，其果實中含有花青素及黃酮等多種活性成分[1]。花青素又稱花色素，多以糖苷的形式存在，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物[2]。研究表明，藍莓花青素具有多種保健功能，在動物體內、體外實驗顯示具有抗腫瘤作用，它的抗氧化作用高于等濃度的抗壞血酸，在治療和預防眼病如緩解視疲勞、白內障、青光眼和視網膜病變等方面顯示了很好的應用前景[3-7]。通常使用傳統的溶劑萃取法提取花青素，這是因為花青素主要以花青素糖苷的形式存在于大自然中，且具有較強的極性[8-9]。提取時，通常使用親水性有機溶劑，如甲醇、乙醇等，以及親脂性有機溶劑，如石油醚、乙酸乙酯等。不同的提取方法會造成一定的溶劑殘留，以致會影響到產品的安全性，它們作為保健食品的生產原料，需對產品進行安全性評價。本文以從藍莓鮮果提取物的花青素為原料，配伍葉黃素制備成藍莓提取物葉黃素制劑，通過急性毒性試驗和30 d 喂養試驗來評價復配藍莓提取物葉黃素制劑的安全性，旨在為藍莓提取物類保健食品的開發利用提供安全性實驗依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

試樣由某生物工程有限公司提供，規格0.5 g/粒，服用量2 粒/日，花青素及葉黃素含量分別為3%、1.2%。該產品的人體推薦量為16.67 mg·（kg bw·d）-1（人以60 kg 計）。

1.2 主要儀器設備

TD12001 型電子天平：余姚市金諾天平儀器有限公司。

1.3 試驗方法

本實驗采用《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003 版）中小鼠急性經口毒性實驗中的最大劑量耐受法，設試樣20 g·（kg bw）-1一個劑量組。共20 只動物，雌性10 只、雄性10 只，經口灌胃給樣，取濃度為0.5 g·mL-1的試樣液兩次給予試樣，兩次給樣間隔5 h，給樣劑量相當于20 g·（kg bw）-1。給試樣14 d 之后，觀察動物的基本狀況、體重變化、死亡情況和中毒癥狀。

參照《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版）進行大鼠30 d 喂養試驗。實驗選取80 只SD 大鼠，按性別、體重隨機分4 組（每組20 只，雌、雄各半），即低劑量組0.42 g·（kg bw）-1、中劑量組 0.83 g·（kg bw）-1和高劑量組1.67 g·（kg bw）-1和一個空白對照組（大豆油）。低、中、高3 個劑量組的劑量分別相當于人體推薦量16.67 mg·（kg bw·d）-1（人以60 kg 計）的25 倍、50 倍和100 倍。采用灌胃給予受試物，按5 mL·（kg bw）-1經口灌胃給予低、中、高劑量組各濃度試樣和大豆油，連續灌胃30 d。實驗過程中，大鼠均單籠飼養，飲水、進食自由。每周記錄進食量、體重，計算食物利用率，末次給試樣后禁食16 h 后稱空腹體重，對每只大鼠腹主動脈取血并進行血液學和血液生化指標檢查，之后對每只大鼠進行臟器解剖觀察，同時取肝臟、腎臟、脾臟和卵巢（睪丸）稱重并計算臟體比；取肝臟、腎臟、脾臟和卵巢（睪丸）等組織，經固定、石蠟切片、H-E 染色和光鏡觀察等進行病理組織學檢查。

試驗數據以平均值（x）±標準差（s）表示，即x±s。方差分析與統計學檢驗采用孫瑞元等編輯的DAS 統計軟件中的多組均數分析方法，即先對試驗數據進行方差齊性檢驗，如果方差齊，就采用單因素方差分析進行總體比較，發現差異后再用Dunnett法進行多個劑量組與一個對照組均數進行兩兩比較；如果方差不齊，則改用秩和檢驗統計。

2 結果與分析

2.1 大鼠、小鼠的急性經口毒性試驗

給予試樣后，14 d 內未見試驗大鼠、小鼠出現死亡情況和中毒癥狀，體重均增加，該試樣雌、雄性大鼠、小鼠經口毒性最大耐受量均大于 20 g·（kg bw）-1（表1）。表明藍莓提取物葉黃素制劑試樣為無毒。

表1 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠、小鼠急性經口毒性的試驗結果（x±s）

2.2 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠體重的影響

由圖1 可知，試驗期間，隨時間的增加，雌、雄大鼠的體重逐漸增加，試樣的低、中、高劑量組中大鼠體重和對照組相比，p＞0.05，即差異均無顯著性意義。試驗結果表明，藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠體重無明顯影響。

圖1 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠體重的影響 （x±s，n=10）

2.3 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠進食量、食物利用率的影響

由圖2 可知，給予雌性、雄性大鼠30 d 不同劑量受試物，雌性、雄性大鼠的體重和攝食量呈正相關，和食物利用率呈負相關。試驗動物高、中、低劑量組的不同性別大鼠體重、體重增加、進食量和食物利用率與對照組相比，p＞0.05，均無統計學差異。各時間點的高、中、低劑量組大鼠周進食量、體重增加和總進食量及總食物利用率、周食物利用率和對照組比，p＞0.05，差異均無顯著性意義。試驗結果表明，藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠周進食量、總食物利用率、周食物利用率均無顯著影響。

圖2 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠周進食量、體重增加和總進食量及食物利用率的影響（x±s，n=10）

2.4 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠血常規各項指標的影響

大鼠喂養試驗30 d 后的血液指標結果顯示，高、中、低劑量組雌、雄大鼠的血常規各項指標，即白細胞、血紅蛋白、紅細胞、淋巴細胞、單核細胞和粒細胞，與對照組相比，p＞0.05，差異均無顯著性意義（圖3）。試驗結果說明，藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠血常規各項指標無明顯影響。

圖3 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠血常規各項指標的影響圖（x±s）

2.5 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠血液生化指標的影響

藍莓提取物葉黃素制劑高、中、低3 個劑量組的雌性、雄性大鼠血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、血糖、總蛋白、白蛋白、球蛋白和白/球等11 項指標與對照組比較，p＞0.05，差異均無顯著性意義（圖4）。試驗結果表明，藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠血液生化指標無明顯影響。

圖4 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠血生化的影響

2.6 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠臟器重量和臟體比的影響

藍莓提取物葉黃素制劑高、中、低3 個劑量組大鼠肝臟、脾臟、腎臟、性腺（睪丸/卵巢）的臟器重量和臟體比，與對照組相比，p＞0.05，差異均無顯著性意義。雌性大鼠中劑量組卵巢重較對照組低（p＜0.05），但未超出實驗室歷史對照范圍，也無劑量依賴性，故無生物學意義（圖5）。試驗結果表明，藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠臟器重量和臟體比也不產生明顯影響。

圖5 藍莓提取物葉黃素制劑對大鼠臟器重量和臟體比的影響（x±s）

2.7 大鼠病理組織學檢查

通過鏡下病理組織檢查發現，高劑量組和對照組大鼠肝臟、腎臟、脾臟和胃腸組織學結構均正常，均未出現增生、脫落、肥大、壞死、萎縮、出血或水腫等現象。高劑量組和對照組大鼠的卵巢、睪丸組織學結構正常，可見正常發育的卵泡、生精細胞，間質未見異常。在中、低劑量組的以上幾種組織的組織病理學鏡下觀察中也均未見異常 現象。

3 結論

藍莓提取物葉黃素制劑的急性毒性試驗中，雌雄兩性大、小鼠經口最大耐受量均大于 20 g·（kg bw）-1，根據急性毒性（LD50）劑量分級標 準，藍莓提取物葉黃素制劑屬無毒級；在大鼠30 d喂養試驗中，藍莓提取物葉黃素制劑的低、中、高3 個劑量組中的大鼠體重、進食量和食物利用率、大鼠血細胞和血液生化指標、大鼠臟器重和臟體比及組織病理學檢查的各項參數與對照組的這些參數相比無異常，未見有毒性反應。藍莓提取物葉黃素制劑的急性毒性試驗及30 d 喂養試驗結果表明，藍莓提取物葉黃素制劑作為保健食品，其食用性是無毒和安全的。