高效液相色譜法測定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精鈉的基質干擾分析及定性確證

丁 梅

（梅河口市食品藥品檢驗檢測中心，吉林 梅河口 135000）

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是食品中應用最廣泛、最常見的食品添加劑，在《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[1]中明確規定了其使用范圍和限量，被國家食品安全監管部門列為重點監測的檢測項目。目前食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉測定方法有液相色譜法[2-8]和氣相色譜法[8-10]和超高效液相色譜串聯質譜法[11]，其中高效液相色譜法因檢驗成本低、前處理簡單、設備通用性和普及性好而成為主要檢測方法之一。目前色譜分析主要是以保留時間進行定性，對于基質復雜的樣品，相同保留時間段常有基質干擾峰出現，尤其是以一種流動相洗脫下的保留時間進行定性往往會出現假陽性樣品。本文根據目標物的出峰時間會隨著流動相pH 值的不同而發生改變這一現象[12-13]，研究以乙酸銨溶液+甲醇（95+5）為流動相出現可疑峰時，再以（甲酸-乙酸銨溶液）+甲醇（92+8）為流動相分析可疑峰，通過不同pH 的兩種流動相洗脫下的保留時間進行綜合定性分析，可以有效避免由樣品基質干擾出現假陽性樣品，在實際檢測工作中效果 較好。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC20AT 高效液相色譜儀（配紫外檢測器，日本島津公司）；重載數顯型渦旋混合器（美國Talboys公司）；KQ-500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KH20R-Ⅱ高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）。

甲醇、甲酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；標準物質苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）。

20 mmol·L-1乙酸銨溶液：稱取1.54 g 優級純乙酸銨（Alfa Aesar），加1 000 mL 水溶解，過0.22 μm濾膜后備用。

甲酸-乙酸銨溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸銨）：在1 000 mL 乙酸銨溶液（20 mmol·L-1）中加入75.2 μL 甲酸，混合后過0.22 μm 濾膜后備用。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Shimpack VP-ODS（5 μm，250 mm× 4.6 mm）；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流動相1：20 mmol·L-1乙酸銨溶液+甲醇（95+5）；流動相2：甲酸-乙酸銨溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸銨）+甲醇（92+8）。

1.3 標準溶液配制

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準儲備溶液：分別準確稱取標準物質各0.01 g 于10 mL 容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容，配制的儲備液濃度均為 1 mg·mL-1。

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標準溶液：分別準確吸取苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準儲備溶液適量，用超純水逐級稀釋配制混合標準溶液，其濃度為 5 μg·mL-1。

1.4 樣品處理

稱取樣品2 g（精確至0.001 g）于50 mL 具塞刻度試管中，加入25 mL 水，渦旋1 min，超聲30 min，加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2 mL，混勻，加水定容至刻度，靜置30 min。取適量上清液于 10 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm 濾膜備用。

1.5 定性分析

以乙酸銨溶液+甲醇（95+5）為流動相，分別進樣混標液和樣液，經色譜柱分離后以保留時間定性，若出現可疑色譜峰時，再以甲酸-乙酸銨溶液+甲醇（92+8）為流動相分析可疑峰，采用兩種流動相洗脫下的保留時間進行綜合定性分析，進一步定性驗證樣品中可疑色譜峰是否為目標峰。

2 結果與分析

2.1 以乙酸銨溶液+甲醇為流動相的檢測結果

隨機選取市售肉千子、蛋糕、冷面、紅方樣品，經前處理后，以乙酸銨溶液+甲醇（95+5）為流動相（流動相1）進行色譜分析，并與混合標準溶液色譜圖進行比較。以保留時間定性可知，肉千子中檢出山梨酸，未檢出苯甲酸、糖精鈉（圖1）；蛋糕中檢出糖精鈉，未檢出苯甲酸、山梨酸（圖2）；冷面中檢出山梨酸，未檢出苯甲酸、糖精鈉（圖3）；紅方中檢出苯甲酸，未檢出山梨酸、糖精鈉（圖4）。

圖1 肉千子樣品和混合標準溶液色譜圖（流動相1）

圖2 蛋糕樣品和混合標準溶液色譜圖（流動相1）

圖3 冷面樣品和混合標準溶液色譜圖（流動相1）

圖4 紅方樣品和混合標準溶液色譜圖（流動相1）

2.2 以甲酸-乙酸銨溶液+甲醇為流動相的定性確證

將上述肉千子、蛋糕、冷面、紅方樣品，以甲酸-乙酸銨溶液+甲醇（92+8）為流動相（流動相2）進行色譜分析，并與混合標準溶液色譜圖進行比較。以保留時間定性可知，肉千子中未檢出苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（圖5）；蛋糕中未檢出苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（圖6）；冷面中檢測出山梨酸，未檢出苯甲酸、糖精鈉（圖7）；紅方中未檢出苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（圖8）。由兩種流動相保留時間綜合定性分析得出，肉千子中山梨酸為假陽性，蛋糕中糖精鈉為假陽性，冷面中山梨酸為陽性，紅方中苯甲酸為假陽性。

圖5 肉千子樣品和混合標準溶液色譜圖（流動相2）

圖7 冷面樣品和混合標準溶液色譜圖（流動相2）

2.3 樣品檢測結果

隨機選取市售樣品基質相對復雜的15 種樣品進行苯甲酸、山梨酸、糖精鈉測定，分別以兩種流動相洗脫進行色譜分析，定性結果見表1。以乙酸銨溶液+甲醇（95+5）為流動相時，15 種樣品中均檢測出食品添加劑；以甲酸-乙酸銨溶液+甲醇（92+8）為流動相時，15 種陽性樣品中有12 種樣品為假陽性，假陽性率80%。這是由于基質復雜樣品僅以一種流動相的保留時間進行定性時，容易出現假陽性樣品，而以兩種流動相保留時間綜合定性驗證，才能使樣品檢測結果更加準確可靠。

表1 樣品中山梨酸、苯甲酸、糖精鈉定性確證結果

圖8 紅方樣品和混合標準溶液色譜圖（流動相2）

3 結論

本研究應用高效液相色譜法測定基質復雜樣品中的山梨酸、苯甲酸、糖精鈉，采用不同pH 的兩種流動相洗脫下的保留時間進行綜合定性分析，可有效避免由樣品基質干擾出現的假陽性樣品的情況。該方法在實際工作中得到了較好的應用，發揮了有效的作用。