獼猴源毛滴蟲的鑒定

李鶴齡 ， 王 宏 ， 陳智崗 ， 宗發(fā)梁

(1. 昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院 ， 云南 昆明 650500 ； 2. 云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點實驗室 ， 云南 昆明 650217)

獼猴(Macacamulatta)是一種重要的非人靈長類動物，也是研究人類健康和疾病的理想動物模型，在普通級環(huán)境中飼養(yǎng)的獼猴，都會受到寄生蟲的侵襲，寄生蟲感染不僅影響自身健康，也會干擾實驗結(jié)果[1]。三毛滴蟲是一種寄生于動物腸道，引起動物反復(fù)腹瀉，營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良，嚴(yán)重影響獼猴質(zhì)量，甚至危及其生命，給獼猴養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的危害。截止目前，三毛滴蟲的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究已在豬[2]、貓[3]等物種中開展，但對獼猴源毛滴蟲的形態(tài)和分子鑒定等方面的研究鮮有報道。本試驗主要對獼猴腸道內(nèi)三毛滴蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并基于18S rRNA基因序列進(jìn)行分析，準(zhǔn)確鑒定出獼猴源三毛滴蟲(Tritrichomonas)，對獼猴三毛滴蟲的診斷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本 隨機(jī)采集30個飼養(yǎng)于開放環(huán)境設(shè)施內(nèi)具有全身消瘦、脫水、糞便呈黃褐色水樣癥狀的獼猴新鮮糞便。試驗獼猴來源于云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點實驗室[SCXK(滇)K2017—0001]。

1.2 儀器及試劑 普通光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，PCR儀(Biometra，美國)，DNA電泳成套設(shè)備(Bio-Rad，美國)，凝膠成像儀(AlphaImager 2200，美國)。2×TaqPCR Master Mix和糞便基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒，購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；盧戈碘液染色劑，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 顯微鏡觀察 于載玻片中央滴1滴生理鹽水，用竹簽挑取少許糞便在生理鹽水中涂抹均勻，涂制成薄而均勻的糞膜，置于光學(xué)顯微鏡下觀察蟲體大致形態(tài)及滋養(yǎng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 毛滴蟲濃集 選取低倍鏡下每個視野平均5個以上毛滴蟲滋養(yǎng)體的糞便樣本。用注射器輕輕吸取5 mL糞便樣本于15 mL離心管內(nèi)，加入5 mL生理鹽水，混勻，用一層滅菌紗布過濾2次，棄沉渣；再加5 mL生理鹽水與濾液混勻，分別用兩層、三層紗布各過濾2次，每次過濾后棄沉渣，3 500 r/min離心5 min。輕微搖晃，棄除上層液及中間雜質(zhì)層，取最下層管底沉積約1 mL于2 mL離心管，加1 mL生理鹽水后3 500 r/min離心5 min，棄上清液。取管底濃集的毛滴蟲樣本用作碘液染色和DNA提取試驗。

1.5 碘液染色 取濃集后的管底樣本10 μL于1.5 mL離心管，再加入10 μL盧戈碘液輕輕混勻，靜置30 s待蟲體著色后吸取10 μL于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 獼猴毛滴蟲基因組DNA提取及PCR鑒定 取濃集后的管底樣本，按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書提取糞便基因組DNA，分光光度計測得DNA濃度>40 ng/μL，OD260/OD280值為1.7～2.0的DNA樣本用于后續(xù)試驗。

1.6.1 18S rRNA基因序列擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[4]中的三毛滴蟲18S rRNA基因引物序列：上游引物 P1(5′-GCTCGTAGTCAGAACTGC-3′)；下游引物P2(5′-CCCAATTAGAACTCTATCTC-3′)，擴(kuò)增蟲體18S rRNA基因序列。PCR反應(yīng)體系：1 μL 模板，12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒純化回收目的DNA，再將回收產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.6.2 5.8S rRNA基因序列擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[5]中的五毛滴蟲5.8S rRNA 基因引物序列：上游引物 P3(5′-TGCTTCAGTTCAGCGGGTCTTCC-3′)；下游引物P4(5′-CGGTAGGTGAACCTGCCGTTGG-3′)，擴(kuò)增蟲體5.8S rRNA序列。PCR反應(yīng)體系參照1.6.1。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳對其進(jìn)行檢測。

1.7 序列比對分析與進(jìn)化樹構(gòu)建 獲得的基因序列應(yīng)用MegAlign軟件與GenBank上已發(fā)表的相關(guān)序列經(jīng)BLAST進(jìn)行同源性比對，并利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析比較不同種來源的毛滴蟲的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察 在高倍鏡下可看到大量梨形、月牙形或近似卵圓形且有力、快速地不停游動的蟲體，運(yùn)動方向不固定，蟲體末端有1根較粗大的軸桿突出于滋養(yǎng)體末端(圖1A)，經(jīng)碘液染色后，在油鏡下可見蟲體呈卵圓形或梨形、蟲體末段有1根鞭毛伸出體外，即為后鞭毛(圖1B)，未見波動膜；在油鏡下可見蟲體前鞭毛，但鞭毛數(shù)目很難在普通光學(xué)顯微鏡下判斷準(zhǔn)確(圖1C)。基于形態(tài)觀察，來源于獼猴腸道的毛滴蟲可初步鑒定為猴源毛滴蟲。

圖1 獼猴源三毛滴蟲的鏡下觀察結(jié)果Fig.1 Microscope observation of Tritrichomonas from rhesus monkeyA：直接涂片觀察的獼猴源毛滴蟲(40×)； B、C：碘液染色后的獼猴源毛滴蟲(100×)A:Trichomonas from rhesus monkey by direct smear (40×)； B，C:Trichomonas from rhesus monkey stained by iodine solution(100×)

2.2 獼猴源三毛滴蟲18S rRNA基因及五毛滴蟲5.8S rRNA基因的克隆與序列分析 對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，9個樣品均獲得500～750 bp的目的基因條帶(圖2)，符合預(yù)期。將目的基因條帶純化回收后測序，獲得的猴源三毛滴蟲18S rRNA基因序列大小為656 bp。

圖2 獼猴源三毛滴蟲18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of Tritrichomonas 18S rRNA gene from rhesus monkey by PCRM:DL-2 000 marker； 1～9：樣品M：DL-2 000 marker； 1-9:Samples

對五毛滴蟲5.8S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，未獲得300～400 bp目的基因條帶。

用DNASTAR的Clustalw法將獲得的18S rRNA序列與發(fā)表在GenBank上的代表性序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)獲得的獼猴源三毛滴蟲(編號：RM060734)18S rRNA序列與分離自腹瀉犬糞便中的胎兒三毛滴蟲(登錄號：AY754332)相似度最高，達(dá)到了97.2%(圖3)。

圖3 獼猴源三毛滴蟲(RM060734)與其他種源毛滴蟲同源性比對Fig.3 Similarity comparison of Tritrichomonas between rhesus monkey(RM060734) with others

2.3 基于18S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 結(jié)果如圖4所示，從獼猴糞便中分離的蟲體與已報道的犬胎兒三毛滴蟲18S rRNA(登錄號：AY754332)以及污水中分離的人畜共患的三毛滴蟲18S rRNA(登錄號：KU939249)形成一個分支，而與其他的毛滴蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，基于18S rRNA基因序列的分析可以鑒定來源于獼猴腸道的毛滴蟲為猴源三毛滴蟲。

圖4 獼猴源三毛滴蟲(RM060734)與已報道不同種源毛滴蟲18S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 18S rRNA of Tritrichomonas between isolated from rhesus monkey(RM060734) with others▲:本試驗所得▲:Obtained in this study

3 討論

毛滴蟲是一種微小的單細(xì)胞原生動物。據(jù)報道，寄生于人、犬、貓、非人靈長類和嚙齒類動物的糞便中的毛滴蟲有胚胎三毛滴蟲[2-3](Tritrichomonasfoetus)和人五毛滴蟲(Pentatrichomonashominis)[6-9]。

人五毛滴蟲主要通過污染飲用水或者食物而被動物或者人誤食而感染，蒼蠅等也有傳播作用，感染后主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉，還會導(dǎo)致肺部感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[10-11]。三毛滴蟲是通過糞—口途徑感染發(fā)病，導(dǎo)致腸道感染和慢性腹瀉[3,12-13],在繁殖群的牛群里面被認(rèn)為是一種重要的性傳播疾病，可導(dǎo)致母牛不孕和流產(chǎn)等[12]，三毛滴蟲還可能是免疫缺陷病毒感染的恒河猴發(fā)生壞死性化膿性胃炎的重要輔助因子[14]。目前，有關(guān)毛滴蟲對獼猴的致病性及采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對毛滴蟲進(jìn)行鑒定的報道較少，所以本次對獼猴毛滴蟲的研究為獼猴毛滴蟲的檢測提供了參考依據(jù)。

毛滴蟲的生命周期簡單，只有滋養(yǎng)體一種形式，其典型特征是滋養(yǎng)體呈1個梨形體或近似圓形，前鞭毛2～4根或3～5根，后鞭毛1根。在不利的環(huán)境條件下，如溫度的突然變化[15]或藥物[16]存在的情況，滋養(yǎng)體有時候會發(fā)生形態(tài)改變，滋養(yǎng)體表面發(fā)生內(nèi)陷，而使鞭毛凹入滋養(yǎng)體內(nèi)部。本試驗采集獼猴的30份糞便直接涂片觀察發(fā)現(xiàn)，有9份感染毛滴蟲，6份感染小袋纖毛蟲，1份感染阿米巴原蟲，1份感染鞭蟲，其余寄生蟲未檢出，毛滴蟲感染率最高。本次從獼猴體內(nèi)看到的毛滴蟲呈蝌蚪狀，運(yùn)動方向不固定，2～5根前鞭毛和1根后鞭毛，但鞭毛數(shù)目很難在普通光學(xué)顯微鏡下判斷準(zhǔn)確，且未發(fā)現(xiàn)三毛滴蟲鞭毛內(nèi)陷現(xiàn)象。基于形態(tài)觀察，來源于獼猴腸道的毛滴蟲可初步鑒定為猴源毛滴蟲。

在蟲種或蟲株水平上開展毛滴蟲的分類研究，對毛滴蟲的診斷和治療等方面都具有十分重要的意義[6]，因此傳統(tǒng)的形態(tài)觀察與分子生物學(xué)研究相結(jié)合的方法對種屬的分類鑒定更為科學(xué)[17]。本試驗利用形態(tài)觀察及三毛滴蟲18S rRNA基因和五毛滴蟲5.8S rRNA基因分析對獼猴的毛滴蟲進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示從獼猴糞便中分離的毛滴蟲與犬胎兒三毛滴蟲18S rRNA基因的相似度為97.2%，并形成一個分支，而與其他的毛滴蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此推斷，從獼猴糞便中分離的毛滴蟲為三毛滴蟲，所采樣本未發(fā)生三毛滴蟲和五毛滴蟲混合感染的情況。該研究方法為獼猴腸道寄生蟲的臨床診斷提供了依據(jù)。