基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術在病原微生物鑒定中的應用

張浩然 ， 孫冰清 ， 徐 汀 ， 黃家鶯 ， 張亦菲 ，田 愷 ， 華賢輝 ， 孟 和

(1. 上海交通大學農業與生物學院 上海市獸醫生物技術重點實驗室 ， 上海 閔行 200240 ； 2. 上海市動物疫病預防控制中心 ， 上海 長寧 201103)

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術最早由田中耕一于1987年提出[1-2]，之后逐漸發展并應用于病原微生物的鑒定[3]。MALDI-TOF MS技術憑借其簡單快速、高效準確等優點[4]，已廣泛應用于食品[5]、水產[6]、人類及獸醫臨床[7-8]等多個領域的病原微生物鑒定工作，在細菌、真菌和病毒鑒定方面，展現了巨大的應用潛力[9]。

本文從細菌、真菌、病毒三方面綜述了MALDI-TOF MS技術鑒定病原微生物的研究進展，探討了該技術的優勢和不足，并給出其發展建議。

1 MALDI-TOF MS的基本原理

MALDI-TOF MS主要包含5個模塊，分別是進樣模塊、離子源、質量分析器、檢測器和數據處理模塊。其中MALDI是離子源，TOF MS是飛行時間質量分析器，兩者是MALDI-TOF MS技術的關鍵部分。

MALDI的主要原理是首先將病原微生物樣品分散在水、甲醇或乙醇等基質中，形成共晶體膜。然后，利用某一波長的激光對共晶體膜進行照射，基質吸收能量后，將其傳遞給樣品，從而令樣品在瞬間蒸發解吸達到離子化的目的[10-13]。TOF MS的主要原理是離子在電場作用下進入飛行管道，由于測定離子的質荷比不同，其在通過管道到達檢測器的飛行時間也不同，從而達到檢測離子的目的[14-15]。利用質荷比和信號強度得到質譜圖，再通過數據處理模塊分析，得到待測病原微生物樣品蛋白的特異性指紋圖譜，并將其與數據庫中的參考圖譜進行對比，從而得到鑒定結果并由此達到病原微生物鑒定的目的[16-17]。

2 MALDI-TOF MS技術在病原微生物鑒定方面的應用

2.1 對細菌的鑒定

2.1.1 對革蘭陰性菌的鑒定 大腸埃希菌為動物和人類臨床常見的病原微生物，致病性大腸埃希菌會導致新生兒敗血癥、影響畜禽和魚類生長繁殖，嚴重威脅人類和動物健康[18-19]。但是，許多國家標準的細菌鑒定方法以生化鑒定為主，其用時長、操作繁瑣，因此部分學者開始尋求新的革蘭陰性菌鑒定技術。

高蕓等[20]采用MALDI-TOF MS技術完成了對豬腸道菌群中的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌等的鑒定，并對mcr-1陽性菌株進行了分型研究，發現了mcr-1在豬腸道菌群中克隆傳播的現象及水平傳播的可能，并且肯定了MALDI-TOF MS技術在細菌鑒定及分型研究中的技術優勢。此外，為探究MALDI-TOF MS技術在革蘭陰性菌鑒定方面的可靠性，王旭暉等[21]將MALDI-TOF MS和VITEK-2全自動微生物鑒定2種技術進行比較，對臨床分離得到的120株常見革蘭陰性菌進行鑒定，差異結果采用16S rDNA測序驗證。結果顯示，115株細菌的鑒定結果相符合，5株不符合，符合率達到95.83%；通過對5株差異菌株進行16S rDNA測序，發現有2株測序結果與VITEK-2鑒定結果一致，3株測序結果與MALDI-TOF MS鑒定結果一致。由此表明，MALDI-TOF MS技術在常見革蘭陰性菌鑒定及分型檢測方面均具有較高的準確性，有助于實驗室人員的日常高通量檢測任務。

2.1.2 對革蘭陽性菌的鑒定 如今，飼料減抗是畜牧業的大勢所趨。因此，作為抗生素的代替品，益生菌類制劑逐漸被畜禽養殖業所關注[22]。根據《飼料添加劑品種目錄(2013)》規定，糞腸球菌、屎腸球菌作為抗逆性較強的益生菌，被允許在飼料中使用。但是，作為機會致病菌，腸球菌也會引起人和動物的多種感染[23]，因此，需要建立快速鑒別糞腸球菌、屎腸球菌等革蘭陽性菌的方法，以規范飼料添加劑市場，從而保障人和動物食品安全。

馬艷寧等[24]利用MALDI-TOF MS技術對2013年1月—2014年9月間臨床分離的革蘭陽性菌進行確認，共鑒定出革蘭陽性球菌3 812株，分別為2 094株葡萄球菌屬共18種、1 254株腸球菌屬共10種、374株鏈球菌屬共19種以及90株其他革蘭陽性球菌9個屬，通過鑒定還發現了常規鑒定方法不能鑒定出的罕見菌種及其亞種。該研究表明，MALDI-TOF MS技術能夠快速準確地鑒定臨床常見的革蘭陽性球菌，并且在罕見菌種鑒定方面具有明顯優勢。此外，王海花等[25]用16S rRNA測序結果分析了MALDI-TOF MS技術和VITEK-2技術鑒定革蘭氏陽性菌的準確性。根據16S rRNA測序結果，33株豬源性腸球菌分別為10株糞腸球菌和23株屎腸球菌。相較之下，VITEK-2技術僅有26株細菌被鑒定至種的水平，其中糞腸球菌8株，屎腸球菌0株，鉛黃腸球菌18株，與測序結果的一致性較低，為21%(7/33)；利用MALDI-TOF MS技術33株細菌全部被鑒定至種的水平，其中糞腸球菌13株，屎腸球菌20株，與測序結果的一致性較高，為88%(29/33)。該研究表明，對于腸球菌的檢定，MALDI-TOF MS技術比VITEK-2技術更具優勢。

另有研究表明[26]，動物源性屎腸球菌會因為傳代次數不同而發生變化，從而影響VITEK-2技術的鑒定結果，這與王海花等[25]的研究結果一致，也進一步解釋了VITEK-2技術在鑒定屎腸球菌方面存在的不足，而MALDI-TOF MS技術存在優勢。

2.2 對真菌的鑒定 真菌又名霉菌毒素。飼料被真菌污染后適口性變差，導致畜禽采食量下降從而影響其生長[27]，還會降低畜禽的繁殖性能甚至損害其肝臟、腎臟等器官[28]。此外，霉菌毒素會在肉、蛋、奶等動物源性食品中富集，威脅人類健康[29]。國際上NHI、Bruker Daltonik等機構相繼建立了質譜數據庫并利用MALDI-TOF MS技術取得了90%以上的鑒定準確率[30-31]。Mcmullen等[32]采用MALDI-TOF MS技術對144株曲霉菌進行了鑒定，鑒定至種水平的有133株，占93.6%，并且能夠將形態學鑒定為屬水平的13株菌進一步鑒定至種。張偉錚等[33]采用MALDI-TOF MS技術鑒定了254株絲狀真菌，并以測序技術對鑒定結果進行驗證，總體符合率為83.97%，其中，毛癬菌屬、毛孢子菌屬和毛霉菌屬符合率為100%，曲霉菌屬符合率為96.5%，并且形態學難以區分的真菌也能夠得到鑒定。

真菌鑒定常用的方法有形態學鑒定和分子生物學鑒定。其中形態學鑒定具有主觀因素，并且很多菌落形態在鏡檢時難以判斷，而分子生物學鑒定對實驗室及操作人員的要求較高且操作復雜，不利于大量樣品的鑒定工作[34]。MALDI-TOF MS技術在真菌鑒定方面準確高效，并且隨著質譜數據庫的不斷更新，其鑒定結果的準確性會進一步提高。

2.3 對病毒的鑒定 雖然MALDI-TOF MS技術主要應用于細菌鑒定，但已有部分研究人員將該技術應用于鑒定病毒的研究中，并且取得了良好進展[35]。萬敏等[36]比較了MALDI-TOF MS技術和表面等離子諧振技術(SPR)對人乳頭瘤病毒(HPV)的鑒定，發現2種技術對國家參考品的檢測結果一致。利用測序技術鑒別了93份陽性樣本(高危型77份)和36份陰性樣本;MALDI-TOF MS技術鑒定陽性樣本82份，陰性樣本32份，分型靈敏性為88.2%(82/93)，特異性為88.9%(32/36)，對高危型樣本的分型準確率為100%(77/77)，說明MALDI-TOF MS技術能夠較好地應用于病毒鑒定。

3 MALDI-TOF MS技術的優勢與不足

3.1 MALDI-TOF MS技術的優勢 目前多數病原微生物鑒定以生化和形態鑒定為主，其成本低且對設備需求不高，但是普遍存在效率低下、準確性欠佳等問題，難以滿足時效性及高通量作業的要求[37-38]。分子生物學鑒定(如16S rDNA技術)的結果可靠，但其檢測成本和操作門檻較高，推廣起來存在諸多限制[39-40]。MALDI-TOF MS技術在病原微生物鑒定方面具有高效、穩定、準確、檢測價格低廉等優勢[38]，有望成為替代傳統生化鑒定和分子生物學鑒定的新技術。

3.2 MALDI-TOF MS技術的不足 MALDI-TOF MS技術最大的局限性在于數據庫。MALDI-TOF MS在鑒定時需要進行數據庫匹配，難以識別沒有添加到數據庫中的病原微生物[41]。國際上一些機構已著手建立數據庫[30-31]，國內的數據庫建立工作也已經起步。鮑春梅等[42]在國際上首次建立了宋內志賀菌質譜數據庫，并利用MALDI-TOF MS技術分別分析了直接涂抹法及提取法對50株宋內志賀菌的鑒定情況，其中，提取法處理的鑒定結果符合率為100%，直接涂抹法處理的鑒定結果符合率為60%。該結果說明，數據庫的建立為MALDI-TOF MS技術的長久發展提供了保障，但不同的前處理方式會干擾鑒定結果。

不僅如此，有研究指出，病原微生物的培養時間[43]、培養基的選擇[44]也會影響鑒定結果。目前，國內部分數據庫圖譜直接引自國外，那么國內外地域環境的差異、實驗室間病原微生物培養方式的差異等，都對數據庫圖譜造成影響，從而干擾鑒定結果[45]。由此引出另一個問題，即缺乏一套標準化的流程。這會使各實驗室操作人員對于MALDI-TOF MS的參數設置、待鑒定病原微生物的培養條件、試驗的前處理方式難以統一，對MALDI-TOF MS技術從新興走向成熟提出了挑戰。

4 MALDI-TOF MS技術的發展方向

4.1 建立數據共享平臺 數據庫看似制約了MALDI-TOF MS技術的發展，實則是該技術擁有無限潛力的有力保證。目前各大品牌的數據庫均支持用戶自我添加，并且會定期進行更新。此外，隨著各領域研究的不斷深入，越來越多的本土化標準圖譜會進一步完善數據庫內容[46-48]，從而逐漸避免因國內外地域差異和試驗操作差異對鑒定結果的影響。因此，目前的首要任務是建立一個完善的數據共享機制，在確保數據科學準確的前提下，讓每個實驗室都能分享各自的標準圖譜，共同打造一個本土化的數據共享平臺，這將是MALDI-TOF MS技術未來的發展方向。

4.2 推行MALDI-TOF MS技術的標準化 國家標準《基質輔助激光解析電離飛行時間質譜鑒別微生物方法通則》(GB/T 33682—2017)的出臺推進了MALDI-TOF MS技術標準化工作的進程。但是，除了頂層的通則標準，還需要在細節上制定相應的方法標準，針對不同病原微生物建立相應的培養、前處理標準流程，建立統一的評判標準等，從而對儀器的規范操作、質控手段、鑒定流程、報告格式等多方面進行統一規范。當然，隨著MALDI-TOF MS技術的廣泛應用，數據庫的建庫標準也必將提上日程。因此，一整套科學規范的標準化體系將是MALDI-TOF MS技術的走向成熟的關鍵。