經口灌胃熊果酸對小鼠結腸、肝和腎組織抗氧化能力的影響

霍明洋 ， 何嘉宇 ， 譚振宇 ， 陳 響 ， 唐 寧 ， 胡蓮薪 ， 郗艷麗

(吉林醫藥學院公共衛生學院 ， 吉林 吉林 132013)

熊果酸(Ursolic acid)，又名烏索酸，屬于α-香樹脂醇(α-amyrin)型五環三萜類化合物，在自然界分布廣泛，在玄參科植物毛泡桐的葉[1]、薔薇科植物烏梅的果[2]、山茱萸科山茱萸果核[3]、木犀科植物女貞的果實和葉[4]、茜草科植物梔子果實[5]、紫葳科植物毛子草的地上部分[6]、目唇形科植物夏枯草果穗[7]、唇形科植物迷迭香葉[8]、冬青科冬青屬植物苦丁茶的葉[9]、薔薇科植物山楂的果[10]、忍冬科植物陸英的花和果實[11]、車前科植物車前草的根、莖和葉[12]、唇形科香茶屬冬凌草地上部分[13]等植物中均檢測到了含量豐富的熊果酸。研究表明，熊果酸具有抗腫瘤[14]、抗炎[15]、鎮靜[16]、抗菌[17]、預防心血管疾病[18]、改善銀屑病樣皮損[19]等功效。體外研究發現，熊果酸能有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基[20-21]。體內研究發現，苦丁茶中的熊果酸能顯著降低四氯化碳引起的小鼠肝組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)水平降低[22]。這表明熊果酸具有非常好的抗氧化能力。但目前關于熊果酸能否作為保健食品，應用于健康機體，有效提高機體的抗氧化能力，延緩機體衰老或者組織衰老等方面鮮有報道。本試驗通過熊果酸連續灌胃的方式，觀察其對健康ICR小鼠肝、腎和結腸組織抗氧化能力的影響，為熊果酸應用領域的拓展提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 ICR小鼠，清潔級，18～22 g，雌雄各半，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，動物合格證號：SCXK(吉)—2018—0007。飼養于吉林醫藥學院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SCXK(吉)2017—0002。基礎飼料喂養，飼料購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號：SCXK(吉)—2015—0005。飼養條件：溫度18～22 ℃，濕度45%～65%，12 h明暗交替。所有試驗均按照美國國立衛生研究院《實驗動物護理與使用指南》和《動物毒理學使用原則》進行，并經吉林醫藥學院醫學倫理委員會批準(許可證號：2018LW011)。

1.1.2 藥品試劑 熊果酸(上海麥克林生化科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)、脂質過氧化物(Lipid peroxidation，LPO)和蛋白定量檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 儀器 Epoch多功能酶標儀(美國BioTek)；NIU科研級正置熒光顯微成像系統(美國Nikon)；QUINITIX124-1CN電子天平(美國塞多利斯)。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組及給藥 ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5個組，即空白對照組、溶劑對照組、熊果酸低、中和高劑量組[5、10 mg/(kg·bw)和15 mg/(kg·bw)]。除空白對照組和溶劑對照組，各組均給予熊果酸混懸溶液(熊果酸溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，現用現配，超聲混勻)灌胃，連續28 d，1 次/d，空白對照組給予相同體積的生理鹽水灌胃，溶劑對照組給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。

1.2.2 抗氧化酶和氧化損傷標志物的測定 切取結腸組織，清理內容物。切取相同部位的結腸、肝組織或者腎組織，用生理鹽水在冰浴下制成10%組織勻漿，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清嚴格按照試劑盒說明書測定結腸組織中POD、CAT、SOD、H2O2、MDA、GSH-Px、LPO、T-AOC、NO和NOS的含量。

2 結果

2.1 熊果酸對小鼠結腸組織抗氧化酶含量的影響 結果如表1所示：隨著熊果酸劑量的增加，小鼠結腸組織中POD、CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC和LPO的含量逐漸降低，NOS含量逐漸升高。熊果酸高劑量組雄性小鼠結腸組織中POD含量顯著低于溶劑對照組和低劑量組(P<0.05)。熊果酸低劑量組雄性小鼠結腸組織中SOD含量顯著高于空白對照組(P<0.05)。熊果酸中劑量組和高劑量組雄性小鼠結腸組織中T-AOC含量顯著低于空白對照組(P<0.05)。熊果酸高劑量組雌性小鼠結腸組織中POD含量顯著低于空白對照組、溶劑對照組、低和中劑量組(P<0.05)。熊果酸低劑量組雌性小鼠結腸組織中LPO含量顯著高于空白對照組和溶劑對照組(P<0.05)。

表1 熊果酸對小鼠結腸組織抗氧化酶含量的影響Table 1 Effects of ursolic acid on antioxidant enzyme contents in colon tissue of mice

2.2 熊果酸對小鼠結腸組織中NO、H2O2和MDA含量的影響 結果如表2所示：隨著熊果酸給藥劑量的增加，NO、H2O2和MDA含量逐漸升高。與空白對照組比較，高劑量組雄性小鼠結腸組織中H2O2水平顯著升高(P<0.05)，高劑量組雌性小鼠結腸組織中MDA含量顯著升高(P<0.05)。與空白對照組、溶劑對照組和低劑量組比較，高劑量組雌性小鼠結腸組織中H2O2水平顯著升高(P<0.05)。

表2 熊果酸對小鼠結腸組織中NO、H2O2和MDA含量的影響Table 2 Effects of ursolic acid on NO,H2O2 and MDA contents in colon tissue of mice

2.3 熊果酸對小鼠肝組織中抗氧化酶和氧化損傷標志物含量的影響 結果如表3所示：隨著熊果酸劑量的增加，小鼠肝組織中GSH-Px、CAT、POD和SOD的含量逐漸增加，而MDA和H2O2的含量則逐漸降低。熊果酸高劑量組雄性小鼠肝組織中H2O2含量顯著低于空白對照組、溶劑對照組、低劑量和中劑量組(P<0.05)，而POD含量則顯著高于空白對照組、溶劑對照組、低劑量組和中劑量組(P<0.05)。熊果酸低劑量組雌性小鼠肝組織中H2O2和MDA水平顯著高于空白對照組和溶劑對照組(P<0.05)，熊果酸中和高劑量組雌性小鼠肝組織中H2O2和MDA水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。熊果酸高劑量組雌性小鼠肝組織中POD水平顯著高于溶劑對照組、低劑量組和中劑量組(P<0.05)。

表3 熊果酸對小鼠肝組織中抗氧化酶和氧化損傷標志物含量的影響Table 3 Effects of ursolic acid on the levels of antioxidant enzyme and oxidative damage markers in liver tissue of mice

2.4 熊果酸對小鼠腎組織中抗氧化酶和氧化損傷標志物含量的影響 結果如表4所示：隨著熊果酸劑量的增加，各劑量組小鼠腎組織中GSH-Px、CAT、POD和SOD含量逐漸升高，而H2O2和MDA含量逐漸降低。與空白對照組和溶劑對照組比較，熊果酸高劑量組雄性小鼠腎組織中POD含量顯著升高(P<0.05)。與空白對照組、溶劑對照組、熊果酸低和中劑量組比較，高劑量組雄性小鼠腎組織中MDA含量顯著降低(P<0.05)。熊果酸低劑量組雌性小鼠腎組織中H2O2含量顯著高于空白對照組和溶劑對照組(P<0.05)。中劑量組雌性小鼠腎組織中POD含量顯著高于空白對照組(P<0.05)，高劑量組雌性小鼠腎組織中POD含量顯著高于空白對照組、溶劑對照組和熊果酸低劑量組(P<0.05)。熊果酸各劑量組雌性小鼠腎組織MDA含量顯著低于空白對照組(P<0.05)。

表4 熊果酸對小鼠腎組織中抗氧化酶和氧化損傷標志物含量的影響Table 4 Effects of ursolic acid on the levels of antioxidant enzyme and oxidative damage markers in kidney tissue of mice

3 討論

現代研究發現，衰老不僅局限于老年人，人類衰老的進程自胚胎發育期已經開始[23]，就臨床角度而言，衰老可以發生在任何年齡階段。衰老除了表現為形體外貌的改變，還可表現為內在組織器官形態結構的改變。在伴隨組織器官老化的過程，其功能亦會發生相應的衰退，從而引發相關疾病。中醫理論認為，組織器官的衰老以虛證為主，其中腎陽虛證分布最廣[24]。肝虛證可包括肝陽上亢證、肝腎陰虛證、肝血虛證、肝氣虛證等，臨床上可表現為頭暈、耳鳴、心悸、目脹痛、口干、口苦、惡心、頭痛、頭昏、嘔吐、消瘦、大便干燥、納呆、沉默寡言、腰痛等癥狀。腎虛包括腎陽虛證、腎氣虛證、腎陰虛證、腎精虛證等，臨床上可表現為乏力、浮腫、心悸、畏寒、咳嗽、納呆、氣短、四肢冷、頭暈、腰酸、神疲、腹脹、尿頻、耳鳴、口干、咽干、大便干燥、失眠等癥狀。

組織器官發生衰老的重要機制之一就是自由基學說。機體內過多的活性氧(ROS)會導致組織器官中的抗氧化酶活性降低，進而形成更多的自由基產物，引起細胞損害，導致機體中許多組織器官出現功能性衰老。抗氧化酶和抗氧化劑是機體內清除自由基的主要物質。適當補充抗氧化劑，不僅可以清除體內過多的自由基，還有利于疾病的防控。如果攝入的抗氧化劑能有效清除自由基的同時，提高體內抗氧化酶的活力，必將有利于機體健康水平的提高，延緩衰老。具有清除自由基能力的天然抗氧劑已成為國內外醫學、生物學、食品科學等領域研究的熱點。

熊果酸是一種存在于多科植物中的五環三萜類化合物，常以游離或結合成糖苷的形式存在于多種植物中，其抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、降血脂、降低血糖、保肝、抗菌、抗炎、鎮定和安定等藥理作用已被證實，且不良反應小，生物安全性高[25]。熊果酸能有效清除自由基，是一種抗氧化性能非常好的天然抗氧化劑[26]。我國有豐富的中醫藥資源，許多常見中藥材中均可提取出熊果酸，其市場應用前景廣闊。深入研究熊果酸對健康機體抗氧化能力的影響，對其在延緩機體或組織器官衰老方面的應用具有十分重要的意義。

本試驗使用的熊果酸灌胃劑量范圍為5～15 mg/(kg·bw)，這與熊果酸口服生物利用度低有關。田娟報道人口服熊果酸后，其吸收呈非線性特征，在40～80 mg/(kg·bw)劑量范圍內，機體對熊果酸的吸收會隨劑量的增加而增加；當劑量高于80 mg/(kg·bw)時，機體對熊果酸的吸收呈飽和狀態，這可能與熊果酸在腸道會被主動外排轉運有關[27]。熊果酸進入腸道系統后，會被腸道黏膜中的外排蛋白排到腸腔，導致腸道系統對熊果酸的吸收差[28]。

本試驗發現，熊果酸灌胃后，ICR小鼠的結腸組織表現出了一定的毒性作用。通過對結腸組織勻漿的檢測發現，小鼠結腸組織的抗氧化酶活力出現降低，如POD、CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC和LPO，而代表細胞氧化損傷的物質MDA、H2O2和NO的水平則出現升高的趨勢。但這種損傷并不十分顯著。從結果推測，這種改變可能是一種可逆性變化，是由于腸道系統大量攝入外源化學物質所致。停藥后，腸道系統的這種變化可能會緩解。該推測有待后續試驗進一步論證。

熊果酸的生物利用率較低，可通過被動擴散方式被腸道組織吸收，熊果酸在小鼠體內組織分布呈顯著差異，其中肝腎組織中熊果酸濃度隨時間延長而逐漸升高，但腎組織中藥物濃度顯著低于肝組織[28]。這表明熊果酸主要通過肝組織代謝，而腎組織僅可排泄極少量的熊果酸原藥。本試驗發現，給予健康ICR小鼠熊果酸灌胃后，小鼠肝組織和腎組織的抗氧化能力顯著提高。這間接論證了熊果酸具有保肝護腎的功效。

綜上所述，熊果酸對小鼠結腸組織有一定的毒性作用，但這種毒性作用并不顯著，這可能是由于腸道系統大量攝入外源化學物質所致。停藥后，腸道系統的這種變化可能會緩解。熊果酸對小鼠的肝臟和腎臟組織有較好的保護作用。將熊果酸制成保健品，或可延緩肝腎組織的衰老。但因熊果酸的吸收效果較差，將熊果酸制成生物利用度高，又不影響生物學功效的劑型是很有必要的，以期更好地為臨床服務。