河南地區豬源腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性試驗

蔣增海 ， 鄧同煒 ， 唐光武 ， 夏艷勛 ， 何啟蓋

(1.河南牧業經濟學院動物醫藥學院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2. 華中農業大學動物醫學院 ， 湖北 武漢 430070)

腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli)是分離于腸道外感染的大腸桿菌，例如致腎盂腎炎大腸桿菌、新生兒腦膜炎大腸桿菌、敗血型大腸桿菌，它們屬于一小部分健康群體腸道中的正常菌群，可無癥狀的定居于腸道，一旦進入腸道外的組織，能夠高效定植，導致人類或者許多種類的動物發病[1]。

在我國，腸外致病性大腸桿菌在病豬中普遍流行，造成嚴重危害。Tan等[2]報道，從我國19個省份送檢的3 127份豬肺臟、心臟、脾臟等樣品中分離到腸外致病性大腸桿菌 315株，檢出率為10.1%(315/3 127)，其中檢出率從2004年的 3.1%上升到2007年的14.6%。馬增軍等[3]報道，2013年12月—2014年7月從秦皇島地區送檢的30份高熱癥狀瀕死的豬病料中分離鑒定出8株腸外致病性大腸桿菌，檢出率為26.67%(8/30)。

本試驗調查了河南地區豬腸外致病性大腸桿菌的流行、耐藥譜和整合子攜帶情況，分析其整合子可變區攜帶耐藥基因，旨在為本地區該病菌感染的預防和控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2016年9月—2018年12月，從鶴壁、鄭州、商丘、平頂山、許昌、新鄉、周口、洛陽、開封、駐馬店和漯河等地61家豬場送檢的病豬中，采集肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、心血、淋巴結等病料，進行大腸桿菌的分離鑒定。

1.2 主要試劑 MH(Mueller-hinto)肉湯，購自英國Oxoid公司；胰蛋白酶大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白酶大豆肉湯(Tryptic soy broth，TSB)，均購自美國BD公司；麥康凱瓊脂和營養肉湯，均購自北京奧博星生物有限公司；腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管 CYZ-15e及配套試劑，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；ExTaqDNA Polymerase、dNTP Mixture、10×ExTaqBuffer(Mg2+plus)，均購自TaKaRa公司；BM2 000 DNA Marker，購自北京博邁德基因技術有限公司；各種藥物，均購自Solarbio公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離培養 采集病豬的肺臟等病料，劃線接種于TSA平板(加有5%犢牛血清和0.01%NAD)，37 ℃恒溫培養12～24 h，挑取圓形、濕潤、半透明、1～2 mm大小的優勢菌落，接種于麥康凱平板進一步純化2～3代；再挑取純化后的單菌落，接種于TSB肉湯，37 ℃搖床培養8～12 h，使用滅菌的甘油溶液，保存于-80 ℃備用。

1.3.2 革蘭染色鏡檢 采用革蘭染色液對分離純化菌株進行革蘭染色，在油鏡下觀察分離細菌形態特征。

1.3.3 生化試驗 按照杭州濱和微生物試劑有限公司生產的腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管 CYZ-15e及配套試劑說明書操作，進行分離菌株的生化試驗，根據生化試驗結果，利用腸桿菌科細菌生化鑒定編碼手冊，檢索細菌鑒定結果。

1.3.4 PCR檢測 利用水煮沸法提取細菌DNA模板。參照文獻[4]合成1對大腸桿菌PCR檢測的特異性引物(EColi-1：5′-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3′,EColi-2：5′-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3′)，擴增特異性片段大小約為264 bp。按照TaqDNA聚合酶試劑的說明書進行PCR體系加樣。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖電泳后，DNA凝膠成像系統分析。

1.3.5 藥敏試驗 選取頭氨芐西林(Ampicillin,AMP)、阿莫西林/克拉維素(Amoxicillin/clavulanate，AMC)、頭孢噻呋(Ceftiofur，EFT)、頭孢曲松(Ceftriaxone，CRO)、慶大霉素(Gentamicin,GEN)、卡那霉素(Kanamycin,K)、鏈霉素(Streptomycin,STR)、四環素(Tetracycline,TE)、強力霉素(Doxycycline，DOX)、環丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(Sulfamethoxazole/trimethoprim,SXT)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SF)、黏桿菌素(Colistin，CT)、氯霉素(Chloramphenicol,CHL)、氟苯尼考(Florfenicol,FloR)16種藥物，以大腸桿菌 (ATCC25922)為質控菌株，依據參考文獻[5-6],采取微量稀釋法藥敏試驗進行豬腸外大腸桿菌分離菌株的耐藥性檢測。

1.3.6 氟苯尼考耐藥基因(floR)的檢測 參考 GenBank上公布的鼠傷寒沙門菌DT104 H3380 菌株floR基因序列(登錄號:NG_047860.1)，利用Primer 5設計1對擴增floR的特異性引物(FloR-1:5′-CTCCCTGTCGTTCCAGCGAT-3′，FloR-2：5′-AGACGACTGGCGACTTCTCG-3′)，擴增大小為1 114 bp，反應條件：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共30個循環；72 ℃ 延伸10 min，最后凝膠電泳分析擴增結果。PCR產物送測序，其測序結果通過BLAST分析，進一步確認floR的檢測結果。

1.3.7 Ⅰ類整合子及其基因盒的檢測 參考文獻[7]分別合成Ⅰ類整合酶基因(intⅠ)及基因盒可變區PCR擴增引物(intI1-F：5′-GCCTTGCTGTTCTTCTACGG-3′，intI1-R：5′-GATGCCTGCTTGTTCTAC GG-3′，擴增片段大小為558 bp；CS-F：5′-GGCATCCAAGCAGCAAGC-3′，CS-R：5′-AAGCAGACTTGACCTGAT-3′，擴增片段大小可變)。PCR 反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55～58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 30 s，共35個循環；最后72 ℃ 延伸10 min。PCR擴增產物經過2%瓊脂糖凝膠電泳分析。基因盒可變區PCR擴增產物純化回收后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果提交NCBI數據庫進行BLAST同源性比對分析。

2 結果

2.1 細菌分離培養 從河南省61家豬場送檢的病豬中采集肺臟、肝臟、心血等樣品，共分離到大腸桿菌可疑菌株17株，檢出率為27.8%(17/61)，分別命名為KFW、WG1、KF、ZMD1、Sq2Hy、YanlinF2、Z1MF、ZMFD、ZhM1F、LKPS、ZhkouX1、ZHM2X、ZhM3X、WSX、ZMD、WSG和WG。肺臟是分離菌株的主要來源，其次是心血和肝臟。其中16株分離菌從保育仔豬中分離到，保育仔豬是最主要的感染年齡階段豬。

2.2 革蘭染色 將分離到的大腸桿菌可疑菌株進行革蘭染色，在油鏡下觀察，均呈革蘭陰性、中等大小的桿菌(圖1)。

圖1 分離菌株的染色鏡檢結果(1 000×)Fig.1 Microscopic examination of the stained isolates(1 000×)

2.3 生化試驗 根據分離菌株的生化試驗結果，利用生產廠家提供的腸桿菌科細菌生化鑒定編碼手冊檢索細菌鑒定結果，顯示所分離的17株細菌均為大腸桿菌。

2.4 PCR檢測 采用PCR擴增法對分離菌株進一步檢測，結果表明分離菌株均能夠擴增264 bp的特異性條帶(圖2)，進一步驗證分離菌株均為大腸桿菌。

圖2 分離菌株的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of the isolates M：BM2 000 Marker； 1～17：分離菌株； 18:陰性對照M:BM2 000 Marker; 1-17:The isolates; 18:Negative control

2.5 藥敏試驗 結果如圖3所示，分離菌株對各種藥物耐藥率普遍較高，其中氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、四環素、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、磺胺甲噁唑、氯霉素、氟苯尼考耐藥率為100%，多黏菌素耐藥率最低為41.18%，頭孢噻呋鈉和頭孢曲松耐藥率均為47.06%，其他藥物耐藥率為58.82%～94.11%不等。由表1可知，分離菌株均為多重耐藥菌株，四重耐藥模式(如ACSuT)的菌株占100%，五重耐藥模式(如ACSSuT)的菌株占58.82%，而七重耐藥模式(如ACSSuT with amoxicillin/clavulanic acid and ceftriaxone)的菌株占35.29%。所有分離菌株都對10種以上藥物耐藥，其中3株分離菌株對16種藥物均耐藥。

表1 17株分離菌的多重耐藥譜Table 1 Multidrug resistance spectrum of 17 isolates

圖3 17株分離菌對各種藥物耐藥率Fig.3 Resistance rates of 17 isolates to various drugs

2.6 氟苯尼考耐藥基因(floR)檢測 分離菌株floR的檢測結果顯示，分離菌株floR的PCR擴增結果均為陽性(圖4)，同時，PCR產物測序結果分析進一步確認分離菌株攜帶floR，由此可以判定17株分離菌株對氟苯尼考的耐藥表型,與其攜帶floR相符合。

圖4 分離菌株floR的PCR擴增Fig.4 PCR amplification of florfenicol resistance gene floR in the isolatesM：BM2 000 Marker； 1～17：分離菌株； 18:陰性對照M:BM2 000 Marker; 1-17:The isolates; 18:Negative control

2.7 Ⅰ類整合子及其基因盒的檢測 分離菌株Ⅰ類整合子及其基因盒檢測結果顯示，分離菌株均攜帶Ⅰ類整合子(圖5)，其中Sq2Hy、ZMD、ZMD1、ZhM1F和WG菌株未擴增出基因盒可變區，其他12株菌擴增出大小為1 000～2 000 bp的片段，通過 BLAST比對分析，發現YanlinF2、ZhM3X、ZMFD、WSX、Z1MF菌株基因盒攜帶dfrA17-aadA5耐藥基因類型，編碼產物對甲氧芐啶和氨基糖甙類藥物耐藥；ZhM2X、LKPS、WG1菌株基因盒攜帶aadA22-aadA23-aadA25耐藥基因類型，編碼產物對氨基甙類藥物耐藥；WSG、ZhKouX1、KFW菌株分別攜帶floR、dfrA12、dfrA12-aadA2耐藥基因，分別對于氟苯尼考、甲氧芐啶、甲氧芐啶-氨基糖甙類耐藥；KW菌株基因盒不攜帶耐藥基因。

圖5 分離菌株Ⅰ類整合子的整合酶基因的PCR擴增Fig.5 PCR amplification of integrase genes in Class I integron of the isolatesM：BM2 000 Marker； 1～17：分離菌株； 18：陰性對照M:BM2 000 Marker; 1-17:The isolates; 18:Negative control

3 討論

腸外致病性大腸桿菌不僅可以正常定植于腸道,而且能侵入體內引起菌血癥,并誘發敗血癥或局部腸道外感染,如腦膜炎、關節炎、肺炎、心內膜炎等[8]。本試驗從河南61家豬場送檢的發病豬中共分離到17株腸外致病性大腸桿菌，檢出率為27.86%(17/61)，相比國內其他地區檢出率稍高，如曾博等[9]報道西南地區豬腸外致病性大腸桿菌檢出率為18.5%，周磊[8]報道在安徽等五省豬場中腸外致病性大腸桿菌檢出率為19.2%。

多重耐藥指至少對3類抗菌藥物具有耐藥性[10]。本試驗結果顯示，全部分離菌株均為多重耐藥菌株，如四重耐藥模式(如ACSuT)的菌株占100%，其中3株分離菌株對16種檢測藥物均耐藥，表明該地區豬源腸外大腸桿菌耐藥性十分嚴重。近年來，全國各地[11-14]報道豬源大腸桿菌對各種藥物耐藥率普遍比較高，如氨芐西林、四環素、氯霉素和磺胺甲噁唑等，但是對頭孢類藥物耐藥率相對低一些，與本試驗結果一致。但是與文獻[11-14]相比，本試驗分離菌株對某些藥物如頭孢類藥物、氨芐西林、氯霉素等耐藥率更高。

整合子作為一個可移動的基因元件，可定位于細菌染色體上，使細菌耐藥性發生垂直傳播，也可借助于質粒、轉座子在不同細菌之間發生水平轉移[15]。本試驗結果顯示，分離菌株均攜帶floR耐藥基因和Ⅰ類整合子，但是有的菌株Ⅰ類整合子基因盒不攜帶耐藥基因，多數菌株攜帶dfrA17-aadA5、aadA22-aadA23-aadA25、dfrA12-aadA2等耐藥基因譜。與其他文獻[16-17]報道相比，本試驗分離菌株中Ⅰ類整合子陽性率更高，表明其自身攜帶的耐藥基因更可能發生傳播的風險。氟苯尼考是目前豬場應用最為廣泛的藥物之一，本試驗分離菌株對氟苯尼考均耐藥，同時均攜帶floR，提示在臨床應用時應注意檢測其藥物敏感性，以免造成治療失敗。