血清胃泌素含量與胃癌患者病灶內上皮間質轉化特征、JAK2/STAT3信號通路活化的相關性

陳明干，龔慶豪，戴剛，朱榮華，張捷

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其具有浸潤性生長的特征，向周圍組織浸潤的癌細胞也成為了胃癌根治術后腫瘤復發及轉移的病理基礎[1]。過度增強的上皮間質轉化及過度激活的Janus相關激酶2(Janus associated kinase 2，JAK2)/信號傳導與轉錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription,STAT3)信號通路是與胃癌病灶浸潤性生長直接相關的病理環節[2-3]，早期通過血清標志物的檢測來評價病灶內的上皮間質轉化及JAK2/STAT3信號通路激活程度，有助于及時判斷胃癌惡性程度、探究胃癌發病分子機制。胃泌素是近年來新發現的胃癌標志物，胃癌患者血清胃泌素的分泌顯著增多，但胃癌病理進程中受到胃泌素調控的生物學環節尚未明確。羅振國等[4]的細胞實驗結果表明，胃泌素對胃癌細胞的上皮間質轉化及JAK2/STAT3通路均具有活化作用。現分析血清胃泌素含量與胃癌患者病灶內上皮間質轉化特征、JAK2/STAT3信號通路活化的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年12月—2021年1月上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院普外科進行根治性切除手術的胃癌患者65例作為胃癌組，其中男37例，女28例，年齡41～65(59.93±11.32)歲；吸煙20例；合并高血壓11例，糖尿病9例；均經術后病理學結果診斷為胃癌，臨床資料完整且術前血清樣本、術后病灶標本保留完整。選擇同期在醫院體檢且排除消化道疾病病史的健康志愿者45例作為健康對照組，男26例，女19例，年齡38～58(58.48±9.29)歲；吸煙14例；合并高血壓7例，糖尿病6例。2組性別、年齡、吸煙史及合并高血壓、糖尿病情況比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(2018120735)，受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀測指標與方法

1.2.1 血清胃泌素測定：胃癌組入組當天或次日、健康對照組體檢當日收集受試者空腹肘靜脈血3 ml，離心獲取血清，采用時間分辨免疫熒光分析法(Thermo公司,SZ8382)測定胃泌素的含量。

1.2.2 病灶內基因表達測定：手術切除后取胃癌病灶及癌旁組織適量，采用北京康為世紀公司提供的試劑盒進行測定：首先通過Ultrapure RNA Kit試劑盒分離組織中的RNA，而后通過SuperRT One Step RT-PCR Kit試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA；取cDNA 2 μl并與2×Taq Plus MasterMix試劑10 μl、引物混合液0.8 μl、去離子水7.2 μl混合，在PCR儀(ABI公司，7500型)上按照95℃ 20 s、特異性退火溫度15 s、72℃ 20 s的反應程序重復40次，得到反應曲線并生成循環閾值(Ct)，代入公式2-ΔΔCt計算E-cadherin、Claudin4、N-cadherin、Vimentin、Snail、ZEB1、Slug、Twist、JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表達量。引物由上海生工公司設計及合成，引物序列及退火溫度見表1。

表1 PCR反應所用引物序列及退火溫度

2 結 果

2.1 2組血清胃泌素比較 胃癌組患者血清胃泌素含量為(19.31±2.24)pmol/L，顯著高于健康對照組的(5.89±0.72)pmol/L(t=38.779，P<0.001)。

2.2 胃癌病灶與癌旁組織內上皮/間質轉化標志基因表達量比較 胃癌病灶內E-cadherin、Claudin4的mRNA表達量明顯低于癌旁組織，N-cadherin、Vimentin的mRNA表達量明顯高于癌旁組織(P均<0.01)，見表2。

表2 胃癌病灶及癌旁組織內上皮/間質轉化標志基因表達量比較

2.3 胃癌病灶與癌旁組織內上皮/間質轉化轉錄因子表達量比較 胃癌病灶內Snail、ZEB1、Slug、Twist的mRNA表達量明顯高于癌旁組織(P<0.01)，見表3。

表3 胃癌病灶及癌旁組織內上皮/間質轉化轉錄因子表達量比較

2.4 胃癌病灶與癌旁組織內JAK2/STAT3信號分子表達量比較 胃癌病灶內JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表達量明顯高于癌旁組織(P<0.01)，見表4。

表4 胃癌病灶及癌旁組織內JAK2/STAT3信號分子表達量比較

2.5 血清胃泌素與病灶內基因表達相關性 胃癌患者血清胃泌素含量與胃癌病灶內E-cadherin、Claudin4的mRNA表達量呈負相關，與胃癌病灶內N-cadherin、Vimentin、Snail、ZEB1、Slug、Twist、JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表達量呈正相關(P均<0.05)，見表5。

表5 血清胃泌素與病灶內基因表達相關性

3 討 論

胃癌的早期診斷有賴于血清腫瘤標志物的測定及消化內鏡下病灶的病理活檢，胃泌素是近年來新發展起來的胃癌標志分子[5-6]。在生理條件下，胃泌素主要由胃竇G細胞分泌，十二指腸、空腸上段細胞也能分泌少量胃泌素；在胃黏膜上皮細胞發生惡變的過程中，胃泌素的分泌明顯增多，進入血液循環能夠成為腫瘤標志物，進入腫瘤病灶局部則能調控癌細胞的惡性生物學行為[7-8]。本研究對胃癌患者血清中胃泌素含量的分析與以往報道的結果一致，胃癌組患者血清中胃泌素含量高于健康對照組。在胃癌的病理進程中，癌細胞表現出極強的浸潤性生長能力，胃泌素促進胃癌浸潤性生長相關的基礎研究表明，JAK2/STAT3通路的過度活化在胃泌素促進胃癌細胞上皮間質轉化中發揮了重要作用[4]。基于此，本研究圍繞胃泌素下游JAK2/STAT3通路及上皮間質轉化分析胃癌患者血清中胃泌素變化的意義。

上皮間質轉化是惡性腫瘤發病過程中重要的生物學特征，表現為極性強且不具遷移、運動能力的上皮特征細胞向無極性且運動能力極強的間質特征細胞分化。E-cadherin、Claudin4是上皮標志基因，能夠維持細胞間的極性及緊密連接，進而使細胞錨定于局部組織、抑制細胞的遷移、運動[9-10]；N-cadherin、Vimentin是間質標志基因，能夠增強細胞的遷移、運動能力[11-12]。在上皮間質轉化過程中會出現E-cadherin、Claudin4表達下調，N-cadherin、Vimentin表達上調。本研究對胃癌病灶內相應基因表達的分析符合上皮間質轉化的特征，即胃癌病灶內E-cadherin、Claudin4的表達量明顯低于癌旁組織，N-cadherin、Vimentin的表達量明顯高于癌旁組織；進一步通過相關性分析證實，胃癌患者的血清胃泌素含量與E-cadherin、Claudin4呈負相關，與N-cadherin、Vimentin呈正相關。這一結果提示，血清胃泌素含量的升高與胃癌病灶內上皮標志基因表達下調、間質基因表達上調有關，結合胃泌素的離體生物學活性可以進一步推測，胃癌患者體內大量分泌的胃泌素能夠促進癌細胞的上皮間質轉化。

上皮間質轉化過程中標志基因表達的改變受到轉錄因子的調控，Snail、ZEB1、Slug、Twist是目前已知調控上皮間質轉化作用最為明確的轉錄因子[13-15]，均能結合E-cadherin基因啟動子區域的E-box序列，進而阻礙基因的表達。已有多項離體細胞實驗研究證實，上述轉錄因子能夠使多種癌細胞內的E-cadherin、Claudin4表達受到抑制，進而增強上皮間質轉化過程[16-18]。在上述研究中對胃癌病灶內上皮間質轉化轉錄因子的分析證實，胃癌病灶內Snail、ZEB1、Slug、Twist的表達量明顯高于癌旁組織。這一結果表明，多種上皮間質轉化轉錄因子在胃癌病灶內呈高表達的趨勢，通過轉錄因子的改變能夠使上皮間質轉化過程得到增強并參與胃癌的病理進程[19-21]。在此基礎上進一步分析胃癌患者體內胃泌素大量分泌與上皮間質轉化轉錄因子高表達的相關性可知，胃癌患者血清中胃泌素的含量與胃癌病灶內Snail、ZEB1、Slug、Twist的表達量呈正相關。這一結果提示，胃癌患者體內大量分泌的胃泌素參與上皮間質轉化的生物學作用可能與調節相應轉錄因子的表達有關。

JAK2/STAT3信號通路是與癌細胞惡性生物學特征密切相關的信號通路，JAK2能夠介導生物學信號由細胞外向細胞內的轉導，進而招募STAT3、使其發生活化并進入細胞核[22-23]；入核后的STAT3能夠啟動基因MMP9、CyclinD1的表達，前者介導細胞侵襲加劇，后者介導細胞周期加速[24-25]。已有離體細胞實驗研究表明，JAK2/STAT3信號通路的過度激活與離體培養胃癌細胞增殖、侵襲能力的增強直接相關，當該信號通路發生激活時，細胞內MMP9、CyclinD1等下游基因的表達相應上調[26]。本研究發現，胃癌病灶內JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的表達量明顯高于癌旁組織，且與血清胃泌素含量呈正相關。這一結果提示血清胃泌素含量的升高與胃癌病灶內JAK2/STAT3通路的激活有關。

綜上所述,胃癌患者血清胃泌素含量升高與上皮間質轉化加劇及JAK2/STAT3信號通路過度激活有關，胃泌素能夠參與胃癌細胞上皮間質轉化及JAK2/STAT3信號通路激活的調控。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

陳明干：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；龔慶豪、戴剛：資料搜集整理;朱榮華：進行統計學分析;張捷：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核