蓯蓉連翹合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉 娟，韓文均，范 偉，時扣榮，張春燕，辛蓓瑋，顧偉鷹，朱建勇

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院，上海 200137）

蓯蓉連翹合劑處方源于上海市名老中醫(yī)葉景華教授的經(jīng)驗方，由肉蓯蓉、連翹、菟絲子、續(xù)斷、巴戟天、佛手6 味中藥組方，已在我院臨床應(yīng)用20 余年［1］，多用于治療早泄，尤其對早泄型射精功能障礙具有良好療效［2］。方中肉蓯蓉為君藥，其味甘咸，性溫，質(zhì)潤，既能補(bǔ)腎陽、又能益精血，補(bǔ)而不峻、補(bǔ)中有通，《神農(nóng)本草經(jīng)》謂其“養(yǎng)五臟，強(qiáng)陰，益精氣”；連翹為臣藥，其性涼味苦，清心降火；菟絲子、續(xù)斷、巴戟天為佐使藥，可補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；佛手具有疏肝理氣、條暢氣機(jī)功效。該方療效確切，安全穩(wěn)定，已獲得發(fā)明專利授權(quán)［3］，為了擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍，擬開發(fā)成院內(nèi)制劑及中藥復(fù)方制劑。為控制蓯蓉連翹合劑質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對合劑中的肉蓯蓉、連翹、佛手進(jìn)行TLC 鑒別，采用高效液相色譜法測定君藥肉蓯蓉中松果菊苷的含量，為蓯蓉連翹合劑的質(zhì)量控制提供客觀的評價方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；CP225D 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DL720 - A 型超聲波清洗儀（上海之信儀器有限公司）；SHZ - D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鄭州博科設(shè)備有限公司）；RV-10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；BD-Ⅱ型多功能紫外分析儀（北京啟航博達(dá)科技有限公司）；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)實驗有限公司）；DNG-9140A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

蓯蓉連翹合劑（醫(yī)院中心實驗室，批號分別為20180601，20180602，20180603）；連翹苷對照品（批號為111670 - 201706，含量為95.1%），松果菊苷對照品（批號為110821-201615，含量為97.2%），柚皮苷對照品（批號為110722-201714，含量為96.2%），均購于中國食品藥品檢定研究院；聚酰胺薄層板（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；硅膠G薄層板（山東省煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

肉蓯蓉［4］：取樣品5 mL，加水稀釋至25 mL，加入石油醚（30～60 ℃），萃取2 次（20，20 mL），棄去石油醚液，剩余溶液再用水飽和正丁醇振搖提取3 次（30，15，15 mL）、合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并定容至5 mL，作為供試品溶液；按蓯蓉連翹合劑處方及工藝，制備缺肉蓯蓉的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液；取松果菊苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，以甲醇- 醋酸-水（2∶1∶7，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

1-3. 供試品溶液（批號分別為20180601，20180602，20180603）4. 對照品溶液 5. 陰性對照品溶液A. 肉蓯蓉 B. 連翹 C. 佛手圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution（the batch numbers were 20180601，20180602，20180603）4.Reference solution 5.Negative reference solutionA.Cistanches Herba B.Forsythiae Fructus C.Citri Sarcodactylis FructusFig.1 TLC chromatograms

連翹［5］：取樣品5 mL，加水至25 mL，超聲（功率600 W，頻率40 kHz，下同）處理10 min，用水飽和正丁醇振搖提取3 次（30，15，15 mL）、合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并定容至5 mL，作為供試品溶液；按蓯蓉連翹合劑處方及工藝，制備缺連翹的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液；取連翹苷對照品，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（8∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

佛手［6］：取樣品5 mL，加水至25 mL，超聲處理10 min，用氯仿萃取2 次（20，20 mL），棄去氯仿液，剩余溶液再用水飽和正丁醇振搖提取3 次（30，15，15 mL）、合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并定容至5 mL，作為供試品溶液；按蓯蓉連翹合劑處方及工藝，制備缺佛手的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液；取柚皮苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法，吸取上述3 批供試品溶液各10 μL、對照品溶液與陰性對照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶6∶2，V/V/V）下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱約5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件［7］

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時80%A→60%A，10～15 min時60%A→50%A，15～20 min 時50%A→80%A；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃。

1. 松果菊苷A. 對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.EchinacosideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取松果菊苷對照品適量，60 ℃減壓干燥4 h，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/ mL 的對照品溶液。取樣品5 mL，加水稀釋至25 mL，超聲處理30 min，放冷，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按蓯蓉連翹合劑處方及工藝，制備缺肉蓯蓉的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及專屬性試驗：取供試品溶液5 μL、對照品溶液與陰性對照品溶液各10 μL，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果理論板數(shù)按松果菊苷峰計大于3 000，基線分離良好；陰性對照品溶液在與對照品溶液色譜保留時間相同處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：分別取2.2.2項下對照品溶液1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，并記錄峰面積。以松果菊苷進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=296.9X+32.92（r=0.999 9）。結(jié)果表明，松果菊苷進(jìn)樣量在1.0～20.0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6 次。結(jié)果松果菊苷峰面積的RSD為1.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8 h時按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果松果菊苷峰面積的RSD為0.31%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密量取同一批（批號為20180601）樣品，共6份，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算松果菊苷的含量。結(jié)果松果菊苷的平均含量為17.45 mg/mL，RSD為0.97%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量（17.45 mg/mL）的樣品（批號為20180601）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的松果菊苷對照品各適量，再按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，并按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定樣品含量。結(jié)果3批樣品中松果菊苷含量分別為17.59，17.40，17.23 mg/mL，平均含量為17.41 mg/mL。

3 討論

本研究中參照2020 年版《中國藥典（一部）》，采用TLC法對肉蓯蓉、連翹、佛手進(jìn)行定性鑒別［8］，并在供試品處理過程中，結(jié)合所含成分極性的差異采取差異化處理，肉蓯蓉中松果菊苷極性較大，故先采用極性小的石油醚進(jìn)行脫脂去除干擾，再以水飽和正丁醇萃取，從而有效富集松果菊苷。鑒別佛手中柚皮苷時，考慮其為苷類物質(zhì)，極性較大，先采用二氯甲烷萃取，去除脂溶性成分，再利用水飽和正丁醇萃取出柚皮苷，所得TLC圖斑點(diǎn)清晰，且陰性對照無干擾。

本研究中松果菊苷的含量測定方法主要參考2020年版《中國藥典（一部）》肉蓯蓉的含量測定方法［8］，由于該合劑中松果菊苷含量較高，故樣品直接以水稀釋，然后濾過，進(jìn)樣測定［9］。另外，梯度洗脫時間設(shè)定為20 min，保留時間相差較大，理論板數(shù)大于3 000，峰形佳且分離度好，基線較穩(wěn)定，組分間互不干擾，操作方法簡易且高效，結(jié)果可靠。

綜上所述，本研究中建立的方法簡便易行，靈敏度高且重復(fù)性好，可用于蓯蓉連翹合劑的質(zhì)量控制。