滋陰益胃膠囊質量標準提升研究*

翟秉濤，王嘉雯，高鳴蕾，秦松瑩，鄒俊波，程江雪，趙宗平，郭東艷△

（1. 陜西中醫藥大學秦藥特色資源研究與開發國家重點實驗室<培育>·陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 西安 712046； 2. 陜西威信制藥有限公司，陜西 西安 710065）

滋陰益胃膠囊組方包括朱砂七、老龍皮、飛天蜈蚣七、天花粉、蒲公英和紫花地丁6 味藥材，具有清熱解毒、活血止痛、滋陰益胃的功效，是臨床治療慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎的常用中成藥。該制劑現行質量標準為原國家食品藥品監督管理總局國家藥品標準［WS -5585（B-0585）-2014Z-2016］。該質量標準鑒別項中以齊墩果酸為對照鑒別飛天蜈蚣七和老龍皮，存在專屬性不強的問題，且缺少對紫花地丁和蒲公英的質量控制內容；朱砂七的含量測定僅以單一大黃素為控制指標，并且供試品溶液制備方法煩瑣。本研究中在滋陰益胃膠囊原質量標準基礎上，結合文獻報道的飛天蜈蚣七［1-2］、朱砂七［3-4］質量評價方法和2020 年版《中國藥典（一部）》紫花地丁、蒲公英［5］質量標準項下有關方法，增加制劑中飛天蜈蚣七、紫花地丁、蒲公英藥材的薄層色譜（TLC）鑒別項，并建立了制劑中大黃素、大黃素- 8 -O-β-D- 葡萄糖苷、虎杖苷、大黃素甲醚和白藜蘆醇5種成分的含量測定方法，為該制劑的進一步開發和質量控制提供可行方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ZF - 7 型紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

滋陰益胃膠囊（陜西威信制藥有限公司，批號分別為200801，200802，201101）；紫 花 地 丁（批 號 為201806066），飛天蜈蚣七（批號為202009021），朱砂七（批號為201910031），老龍皮（批號為202010020），天花粉（批號為202009024），蒲公英（批號為202010018），均購于陜西科興藥業有限公司；蒲公英對照藥材（批號為121195-201503），紫花地丁對照藥材（批號為121429-201605），天花粉對照藥材（批號為121361 - 201603），大黃素對照品（批號為110756-201913，含量≥98%），大黃素甲醚對照品（批號為110758 - 201608，含量≥98%），均購于中國食品藥品檢定研究院；大黃素- 8 -O-β-D- 葡萄糖苷對照品（批號為HR6143W4，含量≥98%），虎杖苷對照品（批號為HR20522B1，含量≥98%），白藜蘆醇對照品（批號為HR14627S1，含量≥98%），L- 瓜氨酸對照品（批號為HR20428W1，含量≥98%），秦皮乙素對照品（批號為HR17123S1，含量≥98%），菊苣酸對照品（批號為121614 - 201603，含量≥98%），均購于寶雞辰光生物科技有限公司；楤木皂苷A對照品（成都普菲德生物技術有限公司，批號為181118，含量≥98%），其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

朱砂七：稱取樣品內容物1 g，精密稱定，加2%硫酸溶液超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，濾過，乙醚萃取3 次，揮干乙醚液，殘渣加無水乙醇，即得供試品溶液。取大黃素和大黃素甲醚對照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含0.2 mg和0.05 mg的單一對照品溶液。取朱砂七對照藥材粉末適量，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液；按滋陰益胃膠囊處方和工藝制備缺朱砂七的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》TLC法［6］試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）上層液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

紫花地丁：稱取樣品內容物3 g，加甲醇超聲處理20 min，精密稱定，濾過后揮干，殘渣加熱水溶解，濾過后蒸干，殘渣再加甲醇溶解，即得供試品溶液。取秦皮乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液［5，7］。取紫花地丁對照藥材粉末適量，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按滋陰益胃膠囊處方和工藝制備缺紫花地丁的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》TLC 法［6］試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯- 乙酸乙酯-甲酸（5∶3∶1，V/V/V）上層液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 B。

天花粉：稱取樣品內容物3 g，精密稱定，加稀乙醇超聲處理30 min，濾過，即得供試品溶液；取L-瓜氨酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg的對照品溶液［5，8］。取天花粉對照藥材粉末適量，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按滋陰益胃膠囊處方和工藝制備缺天花粉的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》TLC 法［6］試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-無水乙醇-冰醋酸-水（8∶2∶2∶3，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴茚三酮試液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

飛天蜈蚣七：稱取樣品囊內容物3 g，精密稱定，加甲醇超聲處理30 min，濾過、揮干，殘渣加蒸餾水溶解，水飽和正丁醇萃取3 次，合并正丁醇液，再用正丁醇飽和氨試液萃取去除雜質3 次，合并正丁醇液，以正丁醇飽和的水萃至中性，合并正丁醇液，揮干后殘渣加甲醇溶解，即得供試品溶液；取楤木皂苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的對照品溶液［1-2］。取飛天蜈蚣對照藥材粉末適量，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按滋陰益胃膠囊處方和工藝制備缺飛天蜈蚣的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》TLC法［6］試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10，V/V/V/V）下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 D。

蒲公英：稱取樣品內容物1 g，精密稱定，加80%甲醇超聲處理20 min，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取菊苣酸對照品適量，精密稱定，加80%甲醇，制成每1 mL 含0.2 mg 的對照品溶液［5］。取蒲公英對照藥材粉末適量，精密稱定，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按滋陰益胃膠囊處方和工藝制備缺蒲公英的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》TLC 法［6］試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷- 乙酸乙酯- 甲酸- 水（6∶12∶5∶2，V/V/V/V）為展開劑進行展開，展開，取出，晾干，噴1%三氯化鋁乙醇溶液，紫外燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 E。

1-3. 供試品溶液 4. 對照藥材溶液 5，5′. 對照品溶液 6. 陰性對照品溶液A. 朱砂七 B. 紫花地丁 C. 天花粉 D. 飛天蜈蚣七 E. 蒲公英圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution 5，5′.Reference solution 6.Negative reference solutionA.Polygonum Cillinerve B.Violae Herba C.Trichosanthis Radix D.Aralia Chinensis L. E.Taraxaci HerbaFig.1 TLC chromatograms

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 1260 TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min時15%A→35%A，30～35 min時35%A→85%A，35～45 min時85%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：290 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

稱取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成白藜蘆醇、大黃素、虎杖苷、大黃素- 8 -O-β-D- 葡萄糖苷、大黃素甲醚質量濃度分別為71.43，71.43，142.86，142.86，28.57 μg/mL 的混合對照品溶液；稱取樣品內容物適量，精密稱定，加70%甲醇，稱定質量，超聲處理10 min，冷卻后再次稱定質量，70 %甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液3 mL，用70%甲醇定容至10 mL，濾過，取續濾液，即得供試品溶液；按滋陰益胃膠囊處方和工藝制備缺朱砂七的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液［3］。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2項下供試品溶液、對照品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陰性對照品溶液在與對照品溶液保留時間相同處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖2。

A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液1. 虎杖苷 2. 白藜蘆醇 3. 大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷 4. 大黃素 5. 大黃素甲醚圖2 高效液相色譜圖A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution1.Polydatin 2.Resveratrol 3.Emodin-8-O-β-D-glucoside 4.Emodin 5.PhyscionFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2.2項下混合對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。詳見表1。

表1 線性關系考察結果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.99%，1.05%，1.06%，0.99%，1.64%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，10，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.57%，0.12%，0.64%，0.62%，0.76%（n= 7），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品適量，精密稱定，各6份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8 -O-β-D- 葡萄糖苷、大黃素、大黃素 甲 醚 平 均 含 量 分 別 為5.61，0.35，8.94，1.00，0.40 mg/g，RSD分別為1.15%，0.74%，1.15%，1.24%，3.05%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品適量，精密稱定，共6 份，分別加入一定質量濃度的待測成分對照品溶液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量。結果見表3。

表3 樣品中5種成分平均含量測定結果（mg/粒，n=3）Tab.3 Results of average content determination of five compo?nents in the samples（mg/capsule，n=3）

3 討論

本研究中在原有朱砂七和天花粉TLC 鑒別項的基礎上增加了紫花地丁、飛天蜈蚣七、蒲公英藥材的定性鑒別。原標準天花粉TLC 項下，供試品采用加稀乙醇加熱回流提取后加鹽酸加熱回流，以氫氧化鈉調pH，操作較復雜，現參考2020 年版《中國藥典（一部）》天花粉TLC鑒別項下供試品提取方法，采用加稀乙醇超聲濾過的方法進行提取［5，9］，操作簡單，且分離效果較好。對飛天蜈蚣七進行TLC 鑒別時，比較了文獻中正丁醇飽和1%氫氧化鈉溶液和正丁醇飽和氨試液2種去除雜質方法對結果的影響，結果顯示，用正丁醇飽和氨試液進行除雜質，斑點清晰且分離效果較好；預試驗中還考察了2種不同的展開系統對TLC鑒別的影響，結果顯示，以氯仿- 乙酸乙酯- 甲醇- 水（15∶40∶22∶10，V/V/V/V）下層液為展開系統相比氯仿-甲醇-水（65∶35∶10，V/V/V）下層液展開效果更佳［1-2］。蒲公英和紫花地丁的定性鑒別方法，參考2020 年版《中國藥典（一部）》蒲公英和紫花地丁薄層鑒別項下供試品提取方法，并且蒲公英以其對照藥材和菊苣酸為對照，紫花地丁以其對照藥材和秦皮乙素為對照，分離效果均較好。

朱砂七為樣品處方中的主要藥材，主要含二苯乙烯和蒽醌類成分，二苯乙烯類成分以虎杖苷為主，具有強心、抗腫瘤及抗氧化等作用；蒽醌類成分以大黃素-8 -O-β-D- 葡萄糖苷為主，具有抗菌、消炎等作用［4，10-11］。故本試驗中在原有的單一大黃素為指標的含量測定的基礎上，增加了白藜蘆醇、虎杖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚4 種成分進行含量測定，能更好地評價樣品質量。同時預試驗中，還比較了加酸水解提取（索氏提取）、純甲醇提取和70%甲醇提取3種不同的樣品處理方法，發現樣品經70%甲醇提取所測得的各對照品成分含量最高，故采用70%甲醇處理樣品。在含量測定方法的建立過程中，分別考察了不同流動相（甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈- 0.1%磷酸水溶液）、不同檢測波長（290 nm、254 nm、210 nm、203 nm）對5 種成分含量測定結果的影響，確定乙腈- 0.1%磷酸水溶液通過45 min 梯度洗脫，在290 nm 波長處的色譜峰形對稱性及分離度均較好［12-13］。

綜上所述，本研究中建立的方法可用于滋陰益胃膠囊的質量控制。但本試驗中未對制劑中老龍皮藥材進行TLC 鑒別，后續有待進一步研究。另外，本試驗中僅以朱砂七中的成分作為指標性成分進行含量測定，后續還需增加其他藥材有效成分作為質控指標，如飛天蜈蚣七中的楤木皂苷A和老龍皮中的網脊衣酸A等，以更好地完善滋陰益胃膠囊的質量標準。