白色念珠菌生長(zhǎng)臨界水分活度研究*

崔 迎，夏 天，任文鑫，李宏鐸，楊曉莉

（1. 陜西省西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710054； 2. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065； 3. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065）

水分活度（aw）是相同溫度下產(chǎn)品水蒸氣壓（P）與純水蒸氣壓（P0）的比值，能反映產(chǎn)品中水的能量狀態(tài)，體現(xiàn)水與產(chǎn)品成分之間結(jié)合的緊密程度［1］。它不僅關(guān)系產(chǎn)品的物理化學(xué)穩(wěn)定性［2］，而且是產(chǎn)品中微生物可利用水的量度，可影響微生物的生長(zhǎng)繁殖［3-4］。隨著aw的降低，微生物的生長(zhǎng)將逐漸受到抑制，當(dāng)?shù)陀谀骋幌拗禃r(shí)，微生物將停止生長(zhǎng)［5］。第29版《美國(guó)藥典·國(guó)家處方集》（USP29-NF24<1112>）“水分活度測(cè)定在非無(wú)菌制劑中的應(yīng)用”發(fā)布［6］，為aw在非無(wú)菌制劑微生物控制方面提供了指導(dǎo)［7］。通過(guò)控制藥品處方中和儲(chǔ)存條件下的aw，減少或消除非無(wú)菌制劑中微生物增殖的風(fēng)險(xiǎn)，以及進(jìn)一步將aw應(yīng)用于制藥工業(yè)，對(duì)于制藥產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)環(huán)境的控制、包裝材料的選擇和藥品成品的保存均有重要意義［8-9］。目前，2020 年版《中國(guó)藥典》中收錄并檢查的代表性微生物生長(zhǎng)所需的臨界aw均有報(bào)道，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉的臨界aw分別為0.97，0.95，0.86，0.90，0.92，0.77；念珠菌的臨界aw雖有報(bào)道，但白色念珠菌卻未找到確切數(shù)據(jù)［1，7，10-16］。基于此，開展了白色念珠菌臨界aw的相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

Aqualab4TE 型水分活度儀（美國(guó)Decagon 公司）；SX-500 型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Tomy 公司）；1300SE?RIES A2 型生物安全柜（美國(guó)Thermo 公司）；MJ - Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SQP型電子天平（德國(guó)Sartorius公司，d=0.01 g）。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)為20151028）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)為3304005）；試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 菌株

白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98001］，為本實(shí)驗(yàn)室保存的工作菌株，傳代次數(shù)為第3代。

2 方法與結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

分別使用不同水分活度調(diào)節(jié)劑（氯化鈉、葡萄糖和甘油）調(diào)節(jié)SDB 培養(yǎng)基，制成系列aw的SDB 工作液（25 ℃），以各水分活度調(diào)節(jié)劑質(zhì)量（X，g）為橫坐標(biāo)、SDB 溶液的aw（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，Y氯= - 0.606 9X氯+ 1.002 1（R2= 0.998 0），Y葡=-0.001X葡+0.999 6（R2=0.995 4），Y甘= -0.002 1X苷+0.997 2（R2=0.993 5）。結(jié)果表明，氯化鈉、葡萄糖和甘油質(zhì)量分別在0～25.00 g，0～140.00 g，0～80.00 g 范圍內(nèi)與aw線性關(guān)系良好。

2.2 臨界aw 定性研究

根據(jù)2.1項(xiàng)所得回歸方程配制氯化鈉、葡萄糖和甘油 為 調(diào) 節(jié) 劑 時(shí) 不 同aw（0.82～0.99，0.87～0.99，0.83～0.99）的系列SDB溶液Ⅰ。每個(gè)aw平行配制3支，每管10 mL，并接種白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物，菌液濃度為103cfu/mL，（25±1）℃條件下培養(yǎng)30 d，再取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至10 mL 未調(diào)節(jié)的SDB 培養(yǎng)基中，（25 ± 1）℃條件下培養(yǎng)5 d。觀察結(jié)果，如出現(xiàn)混濁，表明有白色念珠菌生長(zhǎng)，即可初步確定白色念珠菌的臨界aw。

結(jié)果以氯化鈉、葡萄糖、甘油為水分調(diào)節(jié)劑時(shí)，aw≤0.95，0.88，0.86 的SDB 溶液培養(yǎng)30 d 后3 管培養(yǎng)液均澄清，但轉(zhuǎn)接培養(yǎng)5 d后分別有1，3，3管渾濁，故初步確定，氯化鈉、葡萄糖、甘油培養(yǎng)介質(zhì)下白色念珠菌生長(zhǎng)的臨界aw分別為0.95，0.88，0.86。

2.3 臨界aw 定量驗(yàn)證

分別以氯化鈉、葡萄糖、甘油為水分調(diào)節(jié)劑，配制aw分 別 為0.94，0.95，0.96；0.87，0.88，0.89；0.85，0.86，0.87 的系列SDB 溶液Ⅱ；選取4 個(gè)aw點(diǎn)，包括低于臨界aw0.01 單位、臨界aw、高于臨界aw0.01 單位、未調(diào)節(jié)aw的SDB 培養(yǎng)基（對(duì)照）。每個(gè)aw的SDB 培養(yǎng)液100 mL，接種白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物，菌液濃度為103cfu/ mL，（25 ± 1）℃條件下培養(yǎng)30 d，每1～2 天按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105 傾注平皿法計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)液菌濃度［16］。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、菌液濃度的對(duì)數(shù)（lg）值為縱坐標(biāo)繪制白色念珠菌生長(zhǎng)曲線。結(jié)果見圖1。

A1，B1，C1. 第1次試驗(yàn) A2，B2，C2. 第2次試驗(yàn) A3，B3，C3第3次試驗(yàn)A. 氯化鈉 B. 葡萄糖 C. 甘油圖1 白色念珠菌生長(zhǎng)曲線A1，B1，C1.The first test A2，B2，C2.The second test A3，B3，C3.The third testA.Sodium chloride B.Glucose C.GlycerolFig.1 Growth curve of Candida albicans

可見，在高aw（> 0.99）的培養(yǎng)基中白色念珠菌生長(zhǎng)較迅速，隨著aw降低至接近定性試驗(yàn)的臨界值，其生長(zhǎng)曲線明顯趨緩；當(dāng)aw低于該臨界值時(shí)，生長(zhǎng)曲線呈單調(diào)遞減趨勢(shì)，表明此時(shí)白色念珠菌無(wú)法生長(zhǎng)。

以氯化鈉為培養(yǎng)介質(zhì)，當(dāng)SDB 培養(yǎng)液aw=0.96 時(shí)，白色念珠菌的生長(zhǎng)十分緩慢，已無(wú)明顯對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；當(dāng)aw= 0.95 時(shí)，白色念珠菌先衰減，再生長(zhǎng)；當(dāng)aw= 0.94時(shí)，白色念珠菌數(shù)量逐步遞減直至完全死亡。定量與定性試驗(yàn)結(jié)果一致，故此條件下臨界aw為0.95。

以葡萄糖為培養(yǎng)介質(zhì)，當(dāng)SDB 培養(yǎng)液aw=0.89 時(shí)，3 次試驗(yàn)結(jié)果基本一致，白色念珠菌的生長(zhǎng)曲線緩慢上升。當(dāng)aw=0.88 時(shí)，第1次和第3次試驗(yàn)，白色念珠菌的生長(zhǎng)曲線緩慢上升；第2次試驗(yàn)，其生長(zhǎng)曲線先下降，后緩慢上升，再保持短暫的相對(duì)穩(wěn)定，30 d 之后又開始下降，直至全部死亡，在這個(gè)過(guò)程中，白色念珠菌菌數(shù)始終未達(dá)到初始菌數(shù)并最終降至0，可認(rèn)定為未生長(zhǎng)。當(dāng)aw=0.87 時(shí)，白色念珠菌均緩慢死亡。定量與定性試驗(yàn)結(jié)果一致，故此條件下臨界aw為0.88。

以甘油為培養(yǎng)介質(zhì)，當(dāng)SDB 培養(yǎng)液aw=0.87 時(shí)，白色念珠菌緩慢生長(zhǎng)，30 d 時(shí)3 次試驗(yàn)結(jié)果均表明培養(yǎng)液中的白色念珠菌有增長(zhǎng)；當(dāng)aw=0.86和0.85時(shí)，白色念珠菌菌數(shù)逐漸降低，30 d 時(shí)培養(yǎng)液中均有菌存活，但在40～50 d 時(shí)，菌數(shù)均逐步降至0。定量、定性試驗(yàn)中臨界水分活度不一致，原因?yàn)槎ㄐ栽囼?yàn)中30 d 時(shí)，為方便觀察將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至未進(jìn)行aw調(diào)節(jié)的SDB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件的改變給了aw=0.86時(shí)SDB 培養(yǎng)液中原未完全死亡的白色念珠菌重新生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)，而非白色念珠菌在aw= 0.86 的SDB 培養(yǎng)液中能生長(zhǎng)。故此條件下臨界aw應(yīng)確定為0.87。

綜上，選擇3種介質(zhì)下aw最低值（0.87）為白色念珠菌臨界aw。

3 討論

白色念珠菌的生長(zhǎng)受水分活度調(diào)節(jié)劑種類的影響。在相同的aw條件下對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的抑制作用，氯化鈉較強(qiáng)，而葡萄糖和甘油較弱。這可能與氯化鈉對(duì)微生物具有抑制作用［17］，而其余二者可作為碳源參與微生物生長(zhǎng)代謝有關(guān)［18］。

在臨界aw的定量試驗(yàn)中，以葡萄糖作為水分活度調(diào)節(jié)劑aw= 0.88 的3 次試驗(yàn)中有1 次白色念珠菌無(wú)法生長(zhǎng)，進(jìn)一步檢測(cè)表明，這3 次試驗(yàn)中，白色念珠菌在aw為0.882 7 和0.882 1 時(shí)能生長(zhǎng)，aw為0.879 2 時(shí)則不能，說(shuō)明白色念珠菌在0.88的aw附近十分敏感，也表明研究確定的白色念珠菌臨界aw有較高的可信度。

本研究結(jié)果顯示，隨著aw的降低，白色念珠菌生長(zhǎng)繁殖受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)，這符合aw對(duì)微生物生長(zhǎng)影響的一般規(guī)律。通過(guò)控制aw，可降低藥品中微生物增殖的風(fēng)險(xiǎn)，有助于提高非無(wú)菌制劑質(zhì)量控制的水平，以及減少相關(guān)檢驗(yàn)成本的消耗（單獨(dú)的aw測(cè)量不能作為減少微生物限度檢查的理由）。然而，作為一種廣泛存在于自然界和人體的常見條件致病菌，白色念珠菌早在2005年版《中國(guó)藥典》中便被列為計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌，2010 年版《中國(guó)藥典》起又增設(shè)為控制菌檢查菌，但至今仍無(wú)文獻(xiàn)與研究確認(rèn)其臨界aw。本研究中提供了該部分的試驗(yàn)及結(jié)果，期望有助于未來(lái)《中國(guó)藥典》“水分活度測(cè)定在非無(wú)菌制劑微生物控制中的應(yīng)用”等相關(guān)內(nèi)容的增訂。