鐘倫坤，胡文健，周興瑋，何 嫻，朱佳麗，陳 龍，田 柳，邵建華，孫永東

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 瀘州 646699）

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM）又稱粘液性中耳炎、滲出性中耳炎、卡他性中耳炎等，多發(fā)于2-7 歲兒童，是一種頑固性耳科疾病，病程長(zhǎng)，是兒童聽力受損的最常見原因，主要以中耳積液、聽力下降、反復(fù)發(fā)作為表現(xiàn)特征，治療不徹底或遷延不愈可引發(fā)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒的言語(yǔ)、學(xué)習(xí)和行為問(wèn)題[1]。目前，SOM 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其病因機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議，但目前認(rèn)為中耳的液-氣平衡被打破繼而導(dǎo)致中耳積液是分泌性中耳炎疾病發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，中耳黏膜的免疫反應(yīng)類似于鼻粘膜，其通過(guò)抗原抗體結(jié)合，免疫因子的釋放及下游信號(hào)一系列的瀑布級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，放大免疫反應(yīng)，最終表現(xiàn)為中耳黏膜水腫、滲出，造成中耳積液[2]。但對(duì)于如何快速有效的治療SOM 尚無(wú)統(tǒng)一的治療方案，目前臨床主要以抗感染、抗變態(tài)反應(yīng)及手術(shù)治療等為主要治療方式[3]。因此，尋找療效確切的藥物治療SOM尤為重要。

清竅膠囊是我科獨(dú)創(chuàng)治療SOM 的經(jīng)驗(yàn)協(xié)定方藥，清竅膠囊主要成分包括玄參、生地、丹參、川牛膝等，具有清熱、活血化瘀及抑菌抗菌的作用，主要用于治療肝腎不足、脾氣虛弱型的SOM，2008 年清竅膠囊批準(zhǔn)生產(chǎn)為院內(nèi)制劑，在臨床上應(yīng)用于SOM 及咽喉炎的治療，效果顯著。SOM 主要病理因素鼓膜充血、光錐消失、鼓室混濁、鼓室積液征與SOM 的中醫(yī)病機(jī)咽鼓管閉塞不通、鼓室腔積液而發(fā)病、耳竅失聰、濕困耳竅相契合。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明清竅膠囊能改善機(jī)體免疫功能和中耳粘膜的排泄清理功能，可以達(dá)到標(biāo)本兼治，減緩中耳分泌液的產(chǎn)生，最終吸收消失，使閉塞的咽鼓管逐漸通暢，同時(shí)改善耳蝸微循環(huán)[4]。但其治療SOM的具體機(jī)制及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

T細(xì)胞功能紊亂在SOM發(fā)病中起重要作用。最近的研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）和輔助性T 細(xì)胞（T helper cells-17，Th17）參與了SOM 的發(fā)病[5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）是幼稚T 細(xì)胞發(fā)育為Treg 細(xì)胞或Th17細(xì)胞所必需的，而IL-6 將使幼稚T 細(xì)胞極化為Th17 細(xì)胞[6]。叉頭盒P3（Forkhead Box P3，F(xiàn)OXP3）是Treg 細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（Retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt）是Th17 細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[7]。針對(duì)SOM 中Th17/Treg細(xì)胞失衡的治療方法可能是一個(gè)突破。因此，本研究基于TGF-β1/Foxp3/RORγt 通路探討清竅膠囊對(duì)SOM大鼠的作用機(jī)制，為SOM 的治療提供依據(jù)，同時(shí)也為清竅膠囊的機(jī)制研究及今后基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，系統(tǒng)綜合地觀察清竅膠囊對(duì)SOM 的干預(yù)與影響奠定基礎(chǔ)，為清竅膠囊未來(lái)的藥物開發(fā)及應(yīng)用研究打下更加扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。本文研究流程圖如圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD 大鼠36 只，體質(zhì)量240±10 g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK（川）2019-189，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCYK（川）2020-030。

1.2 藥物

清竅膠囊為醫(yī)院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：川藥制字Z20080310，配方為：玄參9 g、生地9 g、丹參12 g、川牛膝6 g、僵蠶4 g、當(dāng)歸9 g、薏苡仁18 g、豆蔻6 g、甘草9 g。強(qiáng)的松購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021207。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；sigma 3K15 離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品）；BMJ-A 型包埋機(jī)（常州郊區(qū)中威電子儀器廠）；SpectraMAX Plus384 酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；PIKORed 96實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）儀（美國(guó)ThermoFisher）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀5200（上海天能科技有限公司）。

卵清蛋白（OVA）購(gòu)自Sigma（美國(guó)）；IL-4（貨號(hào)：ZC-36402）、TGF-β（貨號(hào)：ZC-37644）、IL-6（貨號(hào)：ZC-36404）、IFN-γ（貨號(hào)：ZC-36294）、IL-10（貨號(hào)：ZC-36379）、IL-17（貨號(hào)：ZC-36386）ELISA 試劑盒（上海茁彩）；TRIzol 試劑RNA 提取試劑盒（批號(hào)：14105，Invitrogen 公司）；PCR 擴(kuò)增試劑盒（批號(hào)：AK9906，TaKaRa）；Foxp3（批號(hào)：MD4713）和RORγT（批號(hào)：MD6907）相關(guān)抗體（Medical Discovery Leader（MDL）公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分泌性中耳炎大鼠模型構(gòu)建

大鼠飼養(yǎng)于恒溫（20-25）℃、恒濕（50%±5%），自然采光，自由飲水條件下。隨機(jī)選取30只進(jìn)行分泌性中耳炎造模[8]：將1.2 mg卵清蛋白溶于0.6 mL PBS緩沖液配置成溶液，同時(shí)使用5.14 mg 的氫氧化鋁作為免疫佐劑，腹腔注射，每周1 次，共2 周，此過(guò)程為全身致敏階段，2周后，用20%烏拉坦以5 mL·kg-1的劑量腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，將15 μL 配置的OVA/PBS 混合液經(jīng)鼓膜前下方注入鼓室，24h 后再次麻醉大鼠，觀察鼓膜狀態(tài)，注射第2次，此為耳內(nèi)激發(fā)階段。24 h 后用耳內(nèi)鏡觀察和記錄鼓膜形態(tài)和中耳腔積液情況，正常大鼠鼓膜無(wú)充血，光滑透亮，錘骨柄和光錐標(biāo)志清晰，鼓室無(wú)積液。建模后可見大鼠鼓膜充血，光錐消失，鼓室混濁，鼓室積液征，建模基本成功。

2.2 試驗(yàn)分組及給藥方法

30 只分泌性中耳炎大鼠造模成功后，隨機(jī)分為模型組（SOM）、強(qiáng)的松治療組（PDN，0.003 g/100 mL）、清竅膠囊低劑量治療組（QQJN-L，0.36 g/100 mL）、清竅膠囊中劑量治療組（QQJN-M，0.54 g/100 mL）、清竅膠囊高劑量治療組（QQJN-H，0.72 g/100 mL），每組6 只，并設(shè)置健康空白對(duì)照組（Control，剩余未造模大鼠6只）。灌胃藥物容積均為0.2 mL/10 g 體質(zhì)量，清竅膠囊高劑量溶液配成濃度為0.72 g/100 mL，清竅膠囊中劑量溶液配成濃度為0.54 g/100 mL，清竅膠囊低劑量溶液濃度為0.36 g/100 mL，強(qiáng)的松配成0.003 g/100 mL溶液。模型組與空白對(duì)照組灌服相同容積的蒸餾水，1次/天給藥，連續(xù)給藥14天。

2.3 樣本采集

血樣采集：給藥結(jié)束后，抽取所有大鼠腹主動(dòng)脈血液，3 000 r·min-1低溫離心15 min，分離血清，-80℃冰箱保存。組織樣本采集：脫頸處死大鼠，取出雙側(cè)聽泡，10%甲醛溶液固定；并立即分離出大鼠脾臟和胸腺，剪少量脾臟和胸腺組織，加入適量淋巴細(xì)胞分離液，充分碾磨胸腺組織至無(wú)塊狀物，過(guò)濾，加入1640培養(yǎng)基，15 000 r·min-1，20℃離心30 min，吸取淋巴細(xì)胞層，用于后續(xù)流式細(xì)胞檢測(cè)。另取部分脾臟和胸腺組織，放入DEPC 處理過(guò)的1.5 mL EP 管中，凍存于-80 ℃冰箱，留待做WB及qRT-PCR檢測(cè)。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.4.1 HE染色觀察組織病理變化

取固定的聽泡，脫鈣，脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟15 min（5 min/次），梯度乙醇水化，1%磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察中耳病理變化。

2.4.2 ELISA檢測(cè)血清因子

將離心采集的血清，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)血清IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17 的濃度。

2.4.3 流式細(xì)胞檢測(cè)脾臟和胸腺Th17/Treg細(xì)胞

取分離好的脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞，稀釋至1×108/mL，取100 μL 加入流式測(cè)定管中，分別加入5 μL FITC 標(biāo)記的CD4 McAb、5 μL APC 標(biāo)記的IL-17 McAb或5 μL FITC 標(biāo) 記的CD4 McAb、5 μL APC 標(biāo)記 的CD25 McAb 后 混 勻，避 光孵 育約20 min，F(xiàn)lowCytometry Staining Buffer 1mL 洗滌后，1400r·min-1離心5 min，棄上清液，加PBS洗2遍，棄上清液，加入PBS緩沖 液，調(diào) 整 細(xì) 胞 濃 度 至1×106個(gè) 細(xì) 胞/mL，于FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD4+IL-17+為Th17 含量，CD4+CD25+Treg細(xì)胞為Treg含量。

2.4.4 qRT-PCR 檢測(cè)脾臟和胸腺組織Foxp3、IL-17、RORγT mRNA表達(dá)

根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用TRIzol?試劑從脾臟和胸腺組織樣本中提取總RNA，電泳確定RNA的完整性后，互補(bǔ)DNA 用RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green試劑進(jìn)行RT-PCR，GAPDH 作為內(nèi)參。qPCR 引物序列為：Foxp3：上游5’-CACCTATGCCACCCTTATCCG-3’，下游5’-CATGCGAGTAAACCAATGGTAGA-3’，IL-17：上游5’-TGGAATCTCCACCGCAATG A-3’，下游5’-TGTGGTAGTCCACGTTCCCA-3’，RORγT：上游5’-CCGCTGAGAGGGCTTC A-3’，下 游 5’-TGCAGGAGTAGGCCACATTACA-3’，GAPDH：上 游5’-AGGTCGGTGAACG GATTTG-3’，下 游 5’-GGGGTCGTTGATG GCAACA-3’。PCR 循環(huán)條件為95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s；40 個(gè)循環(huán)。記錄CT值，并采用2-ΔΔCT法分析mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

2.4.5 WB 檢測(cè)脾臟和胸腺組織Foxp3、RORγT 蛋白表達(dá)

采用RIPA 裂解液從脾臟和胸腺組織中提取總蛋白，應(yīng)用BCA 檢測(cè)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，使用50 μg蛋白在10%的SDS-PAGE 進(jìn)行分離，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封閉結(jié)束后按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕Y(jié)合一抗Foxp3（1:500）、RORγT（1:500）和β-catin（1:2000）4℃孵育過(guò)夜，隨后與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二級(jí)抗體孵育（1：3000）室溫孵育1h，TBST 清洗，ECL 暗室顯色。顯色后的蛋白使用Bio-Rad 全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus 分析光密度，以β-actin 為內(nèi)參，陰性對(duì)照組目標(biāo)蛋白質(zhì)相對(duì)含量為1，計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），兩組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠中耳病理改變

對(duì)照組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，單層黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，上皮下為薄層固有層，內(nèi)含豐富的血管及纖維細(xì)胞等，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或纖維組織增生。模型組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，黏膜上皮細(xì)胞嚴(yán)重壞死、缺失，上皮細(xì)胞基本不可見；黏膜層明顯增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以核呈桿狀的中性粒細(xì)胞和核呈圓形深染的淋巴細(xì)胞為主，較多纖維組織增生，見核呈長(zhǎng)梭形的纖維細(xì)胞，部分細(xì)胞壞死，見胞核崩解、碎裂，胞質(zhì)溶解。強(qiáng)的松治療組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，單層黏膜上皮細(xì)胞排列整齊；黏膜層明顯增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，較多纖維組織增生，見較多核呈長(zhǎng)橢圓形的成纖維細(xì)胞和少量纖維細(xì)胞，固有層略微水腫，見細(xì)胞之間距離顯著增寬。清竅膠囊低劑量治療組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，單層黏膜上皮細(xì)胞排列整齊；黏膜層略微增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，少量纖維組織增生。清竅膠囊中劑量治療組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及極少量纖維組織增生。清竅膠囊高劑量治療組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，單層黏膜上皮細(xì)胞排列整齊；黏膜層極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，以及極少量纖維組織增生。提示清竅膠囊改善SOM 大鼠中耳組織病理形態(tài)變化（圖2）。

圖2 各組大鼠中耳病理改變（HE，400×）

3.2 各組大鼠血清中IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-17 水平明顯升高，IL-10、IL-4 水平明顯降低（P＜0.01）；經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊高劑量組可明顯降低模型大鼠TGF-β、IL-6、IFNγ、IL-17 水平，明顯升高IL-10、IL-4 水平（P＜0.05），提示清竅膠囊抑制促炎性細(xì)胞因子的分泌（表1）。

表1 各組大鼠血清中IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17水平（±s，n=6）

表1 各組大鼠血清中IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17水平（±s，n=6）

注：模型組與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；治療組與模型組比較，#P＜0.05。

組別Group對(duì)照組Control模型組SOM強(qiáng)的松組PDN QQJN低劑量QQJN-L QQJN中劑量QQJN-M QQJN高劑量QQJN-H IL-4（pg·mL-1）22.34±0.32 20.39±0.26*21.98±0.45#21.19±1.11 21.85±1.06 22.08±1.13#TGF-β（pg·mL-1）20.79±1.36 25.49±1.61**23.48±0.29 23.87±0.75 22.91±1.02 22.38±2.06#IL-6（pg·mL-1）10.94±1.24 13.80±0.80**11.85±0.72#12.43±0.69 12.34±0.64 12.22±0.97#IFN-γ（pg·mL-1）157.69±10.57 180.84±6.00**163.29±7.93#167.36±3.91 165.42±3.63 164.55±9.88#IL-17（pg·mL-1）4.47±0.43 5.59±0.45**4.91±0.20#5.05±0.18 4.86±0.16 4.69±0.51#IL-10（pg·mL-1）7.01±0.27 5.61±0.44**6.64±0.64#6.36±0.57 6.46±0.56 6.62±0.36#

3.3 各組大鼠胸腺、脾臟Th17、Treg細(xì)胞含量

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟Th17、Treg 細(xì)胞百分比明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊高劑量組可明顯降低模型大鼠胸腺、脾臟Treg 細(xì)胞（P＜0.05），治療組胸腺、脾臟中Th17細(xì)胞含量較模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示清竅膠囊可能對(duì)Th17/Treg細(xì)胞失衡起到積極作用（圖3-圖4）。

圖3 各組大鼠流式細(xì)胞檢測(cè)圖及結(jié)果比較

圖4 各組大鼠流式細(xì)胞檢測(cè)圖及結(jié)果比較

3.4 各組大鼠胸腺、脾臟Foxp3、IL-17、RORγT mRNA表達(dá)

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟組織中IL-17、RORγT mRNA 表達(dá)水平明顯升高，F(xiàn)oxp3 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊高劑量組可明顯降低模型大鼠胸腺、脾臟組織中IL-17、RORγT mRNA表達(dá)水平，明顯升高脾臟組織中Foxp3 mRNA表達(dá)（P＜0.05），對(duì)胸腺組織中Foxp3 mRNA 表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），提示清竅膠囊治療后Th17/Treg細(xì)胞失衡有所抑制（表2）。

表2 各組大鼠胸腺和脾臟Foxp3、IL-17、RORγT mRNA表達(dá)（±s，n=6）

表2 各組大鼠胸腺和脾臟Foxp3、IL-17、RORγT mRNA表達(dá)（±s，n=6）

注：模型組與空白組比較，**P＜0.01；治療組與模型組比較，#P＜0.05。

組別Group對(duì)照組Control模型組SOM強(qiáng)的松組PDN QQJN低劑量QQJN-L QQJN中劑量QQJN-M QQJN高劑量QQJN-H胸腺Thymus IL-17 1.01±0.17 1.63±0.13**1.33±0.37 1.59±0.12 1.31±0.25 1.22±0.16#RORγT 1.01±0.17 1.99±0.31**1.43±0.14#1.87±0.16 1.52±0.12 1.48±0.34#Foxp3 1.00±0.08 0.63±0.19**0.76±0.12 0.58±0.17 0.72±0.20 0.74±0.06脾臟spleen IL-17 1.00±0.07 2.35±0.38**1.48±0.14##2.13±0.51 1.63±0.31 1.56±0.30#RORγT 1.01±0.14 1.89±0.16**1.56±0.05##1.82±0.07 1.79±0.15 1.77±0.04#Foxp3 1.01±0.19 0.52±0.09**0.78±0.04#0.53±0.13 0.68±0.13 0.70±0.12#

3.5 各組大鼠胸腺、脾臟Foxp3、RORγT蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟組織中RORγT 蛋白水平明顯升高，F(xiàn)oxp3 蛋白水平明顯降低（P＜0.01），經(jīng)不同處理治療后，強(qiáng)的松組、清竅膠囊高劑量組可明顯降低模型大鼠胸腺、脾臟組織中RORγT蛋白水平，明顯升高Foxp3蛋白水平（P＜0.05），提示清竅膠囊可調(diào)節(jié)TGF-β/Foxp3/RORγt 信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)Treg和Th17細(xì)胞介導(dǎo)的中耳炎（圖5）。

圖5 各組大鼠胸腺和脾臟Foxp3、RORγT蛋白表達(dá)

4 討論

針對(duì)SOM 的治療目前尚無(wú)統(tǒng)一有效的藥物，已有證據(jù)發(fā)現(xiàn)中藥具有副作用小，藥物作用靶點(diǎn)多等優(yōu)勢(shì)，對(duì)于SOM 治療中醫(yī)界目前也正在尋找療效確切并且對(duì)全身及局部均有效的中成藥來(lái)治療[9-10]。前期研究證實(shí)清竅膠囊可通過(guò)降低SOM 動(dòng)物模型血清粘附分子表達(dá)水平來(lái)減輕大鼠聽泡粘膜炎癥反應(yīng)，抑制大鼠聽泡粘膜細(xì)胞增生，從而治療分泌性中耳炎[11]。此外，清竅膠囊可抑制SOM 小鼠模型HIF-VEGF 信號(hào)通路因子缺氧誘導(dǎo)因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial cell growth factor，VEGF）濃 度[4]。由 此 看出，清竅膠囊是通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)起作用，但由于更進(jìn)一步機(jī)制研究尚缺乏，故本研究基于TGF-β1/Foxp3/RORγt 通路探討清竅膠囊對(duì)分泌性中耳炎大鼠的作用機(jī)制，為SOM 的治療提供依據(jù)。首先從病理角度觀察發(fā)現(xiàn)分泌性中耳炎大鼠中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，黏膜層明顯增厚，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，清竅膠囊高劑量治療后大鼠中耳內(nèi)單層黏膜上皮細(xì)胞排列較整齊，黏膜層極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。提示清竅膠囊改善SOM病理變化，對(duì)SOM具有治療作用。

目前，SOM 的發(fā)病機(jī)制尚不清晰，然而研究顯示免疫因素在SOM 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制有待深入研究[12]。在自身抗原的刺激下，Treg 細(xì)胞和其他T 細(xì)胞亞群可以在胸腺中發(fā)育。胸腺Treg 細(xì)胞在維持免疫耐受中的關(guān)鍵作用已通過(guò)觀察3 日齡新生小鼠胸腺切除誘導(dǎo)T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫得到證實(shí)[13]。Treg 抑制功能的維持需要轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 的表達(dá)，其功能本身受多種翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。Treg細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子（TGF-β、IL-10）及通過(guò)CD39 胞核水解ATP 抑制免疫反應(yīng)，而Foxp3 可在TGF-β 存在的情況下在體外誘導(dǎo)Treg[14]。輔助性T 細(xì)胞（Th17）由視黃醇相關(guān)孤兒受體γt（RORγT）誘導(dǎo)，在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15]。全基因組關(guān)聯(lián)研究強(qiáng)調(diào)了Th17 細(xì)胞在免疫性疾病中的中心作用，這些研究將Th17細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的基因與多種疾病聯(lián)系起來(lái)，包括牛皮癬、炎癥性腸病和強(qiáng)直性脊柱炎[16-17]。此外，Th17 細(xì)胞可分泌IL-17，Treg 細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞型，具有維持免疫穩(wěn)態(tài)、降低炎癥強(qiáng)度和誘導(dǎo)免疫耐受的作用，細(xì)胞間相互作用和分泌IL-10 是Treg 細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫的主要途徑[18]。與Treg細(xì)胞相反，Th17 細(xì)胞被指出具有促炎功能，Th17 細(xì)胞分泌過(guò)多的IL-17 會(huì)招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，增加腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β 的產(chǎn)生，進(jìn)而加重疾病[19]。RORγT 是治療Th17細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的一個(gè)有吸引力的藥理靶點(diǎn)，盡管這些分子抑制了某些在Th17 細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄，但RORγT抑制劑的直接轉(zhuǎn)錄效應(yīng)尚未被分析，也沒有全面研究這些分子對(duì)RORgt 靶點(diǎn)及其轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的影響[20]。研究報(bào)道Klotho 蛋白可能通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Foxp3/RORγt 信號(hào)通路抑制宮頸癌荷瘤小鼠體內(nèi)Treg 和Th7 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫逃逸，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。本實(shí)驗(yàn)研究清竅膠囊對(duì)分泌性中耳炎TGF-β1/Foxp3/RORγt 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，分泌性中耳炎模型大鼠TGFβ、IL-6、Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、IL-17、RORγT、IFN-γ水平明顯升高，IL-10、IL-4、Foxp3 水平明顯降低，而清竅膠囊可明顯降低模型大鼠TGF-β、IL-6、Treg 細(xì)胞、IL-17、RORγT 水平，明顯升高IL-10、IL-4、Foxp3水平。表明清竅膠囊可有效地調(diào)節(jié)TGF-β/Foxp3/RORγt 信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)Treg 和Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的中耳炎。

綜上所述，清竅膠囊可有效地調(diào)節(jié)TGF-β/Foxp3/RORγt信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)Treg和Th17細(xì)胞介導(dǎo)的中耳炎的發(fā)生及發(fā)展，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞失衡狀態(tài)，改善分泌性中耳炎。