網絡藥理學聯合分子對接研究藏藥六味木香丸治療胃癌的分子作用機制＊

仁青東主，馮學梅，洛桑東智，華青措，英 措，劉軍莉，桑杰卓瑪，格日多杰，索南才旦多杰，三智加

（1.青海大學藏醫學院 西寧 810001；2.青海省藏醫院 西寧 8100071；3.青海大學醫學院 西寧 810001）

六味木香丸藏醫稱“日達州巴”，最早收載于《四部醫典》，由木香、豆蔻、余甘子、蓽茇、巴夏嘎、石榴子等六味藏藥材組成，主治“培根木布”病為主[1]。文獻研究表明[2]，木香為菊科植物木香的根，主治胃腸鼓脹、息肉等功效。豆蔻為姜科植物白豆蔻的果實，主治脾胃不和、脘腹脹滿等癥。余甘子為大戟科植物余甘子的果實，主治消化不良、腹脹等癥。蓽茇為胡椒科植物蓽茇果穗，主治脘腹冷痛、嘔吐等癥。塞北紫堇稱“巴夏嘎”，主治赤巴熱、刺痛、血熱病等。石榴子為石榴科植物石榴的種子，主治食欲不振，胃寒痛，消化不良等癥?，F代研究表明，續艷麗等[3]通過六味木香丸的有效成分分析，發現該方劑對胃潰瘍的炎癥具有抑制作用。魯建美等[4]發現，六味木香丸對胃部炎癥起到抗炎、鎮痛的作用。李海峰等[5]通過72 名腫瘤化療患者的臨床觀察，發現該方劑對化療藥物的不良反應如惡心、嘔吐等具有緩解作用。徐僮等[6]對藏藥六味木香丸的有效成分進行分析，其君藥木香所含木香烴內酯、去氫木香內酯為主要成分，具有抗炎、腫瘤作用?？傊?，藏醫六味木香丸的總體功效圍繞胃病及寒熱混合證為主，其成分也表明對治療胃癌具有潛在的挖掘價值。

胃癌是我國發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。其發生發展過程一般經歷慢性淺表性胃炎，慢性萎縮性胃炎，腸上皮化生，異型增生等幾個階段后，最終演化成胃癌[7-8]，各個階段涉及不同的信號通路或者相同的信號通路。由于胃癌發生早起患者并不能發行明顯或者特殊癥狀，這種發病的潛伏性導致很多患者發現時已經處于胃癌中晚期，因此，必須通過手術、化療和急性靶向藥物來達到抑制的目的，但復發轉移率仍然很高，且手術創傷性極大，化療和藥物引起的副作用也很大。已有研究表明，民族醫藥因獨特的復雜配方在預防和治療胃癌方面顯示出了獨特的療效，可以有效的避免上述幾種治療方式的缺點。

為了發現防止胃癌的藏藥良方，課題組利用中醫傳承輔助平臺軟件（V2.0）數據分析平臺，對慢性萎縮性胃炎及癌前病變的115 名患者所使用的690 首方劑進行分析，得出六味木香丸治療萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃癌前病變的療效顯著，其胃鏡、病理活檢、癥狀的有效率分別達86%、86.6%、97.1%[9-12]。通過用藥物頻次、關聯規則、核心組合、新方分析，得出六味木香丸是治療該類疾病的核心組方[14]?；谇捌诎悬c預測研究，發現該方劑主要通過ABL1、F2、ESR1、CYP2C9 等關鍵靶蛋白，調控androgenand estrogen metabolism、cytochrome P450、ErbB 等通路，參與細胞增殖、氧化反應、內分泌代謝、DNA 轉錄等過程，從多靶點、多通路協同作用，可能遏制慢性萎縮性胃炎的進一步惡化[13]。但六味木香丸如何有效防止胃癌的作用機制至今還不完全清楚。基于上述背景，本研究聯合利用網絡藥理學和分子對接的方法，探索六味木香丸作用于胃癌的信號通路、代謝通路及潛在的疾病標志物等作用機制，預測六味木香丸抗胃癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藏藥化學成分及作用靶點信息獲取及收集

六味木香丸組成藥物中的木香、余甘子、豆蔻、蓽茇、石榴子等五種藥材的化學成分及作用靶點信息獲取及收集從中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），篩選條件設置為口服生物利用度（OB）＞30%且類藥性（DL）＞0.18。巴夏嘎（塞北紫堇）的化學成分在TCMSP 平臺未能檢索到，所以從文獻查閱整理[14-18]，然后將成分在TCMSP 平臺進行檢索，滿足OB 和DL 篩選條件的作為有效成分。此外，在TCMSP 平臺上檢索不到，但是文獻報道和腫瘤相關的成分也作為有效成分進行后續分析。所有藥物的化學成分的靶點從首先從TCMSP 中查找，然后查閱文獻進一步補全。

1.2 疾病胃癌靶點選取

運 用 DrugBank、 GeneCards、 OMIM、 TTD、PharmGkb五大疾病數據庫，輸入與“胃癌”關鍵詞獲取胃癌疾病靶點，后經合并去除重復項獲取得到胃癌疾病最終靶點。

1.3 胃癌疾病靶點與藥物靶點映射

使用R 語言中的“Venn”包構建藥物活性成分相關的靶點和疾病靶點的維恩圖（venn）獲得六味木香丸活性成分的潛在抗胃癌作用靶點。

1.4 藥物-共活性成分-關鍵靶點網絡的構建

通過上述整理獲得“藥物-成分”、“成分-疾病靶點”文件后，采用Cytoscape 軟件（Version 3.8.0）構建“藥物-活性成分-靶點”關系網絡。

1.5 關鍵靶點蛋白相關作用網絡的構建

首先預測上述獲得的關鍵蛋白之間的關系，在STRING 數據庫平臺（https://string-db.org/Version10.5）上完成預測。并將預測的結果以TSV 格式導出。采用Cytoscape軟件（Version3.8.0）構建“蛋白-蛋白”關系網絡。并用插件CytoNCA獲得核心蛋白網絡。

1.6 通路注釋與富集分析

使用R 語言中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”和Bioconductor 包“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”“pathview”完成GO和KEGG富集分析。

1.7 關鍵化合物和核心蛋白分子對接

將潛在靶點蛋白名稱輸入PDB（http://www.rcsb.org/pdb/）數據庫中，找到相應蛋白的PDBID，保存為pdb 格式，從TCMSP 數據庫查找靶蛋白對應的化合物成分，下載保存為mol2 格式，在PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取核心活性化合物2D 結構的sdf 格式文件。使用Pymol 軟件對原PDB文件進行去除水和原配體處理，Autodock Tolls 軟件為靶蛋白受體分子加極性氫，通過Autodock Vina 和Python腳本實現分子對接。分子對接過程中其結合能越低代表受體與配體的親和力越好，本研究選取結合能≤-5.0 kJ·mol-1的作為化合物與靶點有效結合的篩選依據。

1.8 實驗驗證

1.8.1 準備供試藥物

六味木香丸購自青海省藏院,制劑批次號：20210904。200 g 六味木香丸在1 L 85%的乙醇中超聲提取3 次，將提取液進行濃縮，得到約50 mL 濃縮液，按照藥物和培養液1:1 的比例配置六味木香丸提取供給母液，然后按照每100μL 培養液里面添加1.8、3.6、5.4、7.2 μL 六 味 木 香 丸 母 液，分 別 命 名 為LWMXW1、LWMXW2、LWMXW3、LWMXW4，不添加藥物的為CK對照組。

1.8.2 細胞實驗過程

人胃細胞系SGC-7901（產品編號C6795）購自碧云天。細胞在RPMI1640（批號C11875500BT，Gibco公司）基礎培養液并含10%胎牛血清（批號42F7180K，Gibco 公司）中貼壁培養，培養條件為95% 空氣+5%CO2，溫度為37°C。當細胞密度生長到約85%左右時用重組胰酶細胞消化液（產品編號C0209）進行消化，鋪96 孔板（8×103個/孔）的細胞用于檢測細胞增殖和活性氧積累，鋪100 mm 細胞培養皿（8×105個/皿）的細胞用于分析蛋白表達。細胞處理分對照組（RPMI1640）和不同濃度六味木香丸組（）。細胞經藥物處理24 h 和48 h 后，將96 孔板中的處理液洗掉，用PBS 清洗兩次后，每孔添加配置好的CCK-8 試劑（C0037）100 μL，培養箱中繼續培養30 min 后，用酶標儀（SuPerMax 3000AL）測定各孔的450 nm 的吸光值，以空白對照組為參照，計算細胞相對活力。100 mm細胞培養皿中的細胞處理完后，先用PBS 清洗兩次后，用胰酶進行消化，隨后按照RIPA 裂解液(強)試劑盒（產品編號：P0013B）說明書提取蛋白，用BCA 蛋白測定試劑盒（產品編號：P0012S）測定蛋白濃度，用15%的 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）凝膠分離20 μg/孔的蛋白，隨后轉到polyvinylidene fluoride（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉室溫下在脫色搖床上封閉1 h。然后加入兔抗STAT3 多克隆抗體（1:500，Order NO.:D320083），4℃下孵育過夜，用Tris Buffered saline Tween（TBST）在室溫下脫色搖床上洗5 次，每次5 min，隨后添加山羊抗小鼠IgG（1:5000）二抗，在室溫下孵育1 h，并用TBST 在室溫下脫色搖床上洗5 次，每次5 min。將極超敏ECL 化學發光試劑（產品編號：P0018FS）滴加至PVDF膜上，在暗處進行曝光、顯影和定影。

2 結果

2.1 活性化合物的收集

通過查閱文獻和TCMSP 數據庫共獲得六味木香丸有效活性成分42 個，其中槲皮素（quercetin）和木犀草素（luteolin）在余甘子、石榴子和豆蔻中都含有，此外，(+)-兒茶素（(+)-Catechin）、β - 谷 甾 醇（β -sitosterol）、鞣 花 酸（ellagic acid）、山奈酚（kaempferol）在石榴子和余甘子中都存在。而且我們發現不同的化合物可以作用于同一個靶點，PTGS1 是化合物tetrahydrocoptisine、quercetin、Pisatin、Pinocembrin、luteolin、 kaempferol、 Jaranol、 Cavidine、 Benzo[a]carbazole、7-O-Methyleriodictyol、5- [(2R, 3R) -7-methoxy-3-methyl-5- [(E) -prop-1-enyl] -2, 3-dihydrobenzofuran-2-yl]-1,3-benzodioxole、1,2,5,6-tetrahydrotanshinone、(2R) -7-hydroxy-5-methoxy-2-phenylchroman-4-one、(+)-catechin、tetrahydrocoptisine

的共同靶點（表1）。

表1 六味木香丸潛在活性成分和對應靶點信息

續表

2.2 活性化合物靶點和疾病靶點

胃癌的8953 個靶點與六味木香丸的301 個靶點利用R 語言進行匹配映射，并繪制維恩圖（venn）獲得271 個共同靶點，進一步確定了六味木香丸與胃癌的靶向作用關系（圖1）。

圖1 六味木香丸活性成分靶點和胃癌疾病靶點維恩圖

2.3 藥物-成分-靶點網絡分析

將六味木香丸的42 活性成分與271 個潛在作用靶點導入Cytoscape 中，繪制藥物-成分-靶點網絡圖（圖2）。度值表示預測出該成分與作用靶點的關聯個數，成分度值越大說明該成分越重要，此外發現一個成分存在于多個藥物中，一種成分可與多個靶點作用，多種成分又可共同作用于同一個靶點，體現了藏藥復方多成分、多靶點和協調遞增效應的綜合治療特色。

圖2 “藥物-化合物-靶點”網絡圖

2.4 PPI網絡圖構建

在STRING 數據庫中導入271 個潛在靶點，得到PPI 網絡關系信息，發現243 個具有節點連接，刪除那些沒有節點連接的蛋白，保存網絡，并導入Cytoscape對蛋白網絡進行可視化分析，構建PPI 網絡圖（圖3）。其中degree＞24（中位數）的有MAPK1、MAPK3、JUN、STAT3、AKT1、TP53、RELA、MAPK8、FOS、MAPK14 等22 個靶點。借助Cytoscape 軟件的cytoNCA 插件對潛在治療靶點進行拓撲屬性分析獲得核心富集模塊主要涉及MAPK3、MAPK1、AKT1、JUN、TP53等。

圖3 六味木香丸對抗胃癌靶點蛋白相互作用網絡圖（A：第一次篩選，B：第二次篩選）和關鍵基因相互作用網絡圖（C）

2.5 富集分析

利用R 語言相關富集分析包對靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，結果見圖4，GO 分析結果顯示六味木香丸的活性成分左右的相關蛋白基因主要富集到生物學過程中的氧化脅迫應激、藥物反應應激和營養水平應激，分子功能DNA 結合轉錄激活和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性以及細胞組分中膜相關功能。KEGG生物學過程主要涉及：PI3K-Akt，MAPK，IL-17，TNF，HIF-1等信號通路（圖4）。

圖4 六味木香丸治療胃癌的KEGG功能柱狀圖

2.6 活性化合物與核心靶點蛋白受體的分子對接結果

首先查找獲得PPI網絡圖構建過程中篩選得到的4 個核心靶蛋白（MAPK3、MAPK1、JUN、STAT3）后，利用AutoDock Vina 軟件和Python 腳本進行核心靶蛋白和對應化合物的分子對接，根據活性化合物與靶點蛋白受體間的結合活性度越高，則兩者結合能月底的原則，本研究發現5 個活性化合物與4 個核心蛋白受體對接結果均低于-5.0 kJ·mol-1，其中Beta-sitosterol 與JUN 的結合能是-26.42 kJ·mol-1，是結合能最大的，其它結合能均低于30 kJ·mol-1，其中Quercetin 與JUN 的結合能32.58 kJ·mol-1，Luteolin 與MAPK1 結合能32.37 kJ·mol-1，(- ) -epigallocatechin-3-gallate 與MAPK3、MAPK1、JUN、STAT3 的結合能分別為35.80 kJ·mol-1、33.75 kJ·mol-1、32.94 kJ·mol-1、37.52 kJ·mol-1（表2）。這些結果說明六味木香丸活性化合物和胃癌核心靶點之間具有很好的結合能力。具體的對接結果見圖5-圖6，從對接圖我們發現，Quercetin、Luteolin 和(-)-epigallocatechin-3-gallate 與MAPK1 靶蛋白的結合位點完全相同，其坐標是center_x =-7.922，center_y = -13.532，center_z = 20.697。 Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Beta-sitosterol 和(-)-epigallocatechin-3-gallate 與JUN 靶蛋白的結合位點完全相同，其坐標是center_x =10.201，center_y = 0.493，center_z =19.492。(-)-epigallocatechin-3-gallate 與STAT3 靶 蛋 白的 結 合位 點 坐 標是center_x = -43.83，center_y = -43.908，center_z =8.422。 (- ) -epigallocatechin-3-gallate 與STAT3 靶蛋白的結合位點坐標是center_x = 15.01，center_y=-7.833，center_z=24.602（圖6）。

圖5 活性化合物與核心靶蛋白分子對接圖

圖6 (-)-epigallocatechin-3-gallate 與MAPK3(A)、MAPK1(B)、JUN(C)和STAT3(D)分子對接圖

表2 化合物與核心靶點結合能

2.7 六味木香丸對胃癌細胞增殖和STAT3 蛋白表達的影響

本實驗利用CCK-8 法檢測不同濃度的六味木香丸處理SGC-7901 胃癌細胞48 h 或72 h 后細胞增殖（圖7）。與空白對照組相比，六味木香丸能不同程度地抑制人胃癌SGC-7901 細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性，其中以1 μg·mL-1處理72 h 抑制最明顯（P＜0.001）。利用蛋白質印跡法進一步檢測六味木香丸對STAT3 蛋白表達的影響（圖8），結果表明與對照相比，六味木香丸顯著的抑制了STAT3 蛋白的表達，表明STAT3通路可能參與六味木香丸抑制胃癌過程。

圖7 CCK-8法檢測六味木香丸不同濃度和作用時間對SGC-7901細胞增殖能力的影響

圖8 六味木香丸處理SGC-7901細胞48 h對STAT3蛋白表達水平的影響

3 討論

藏藥方劑具有所含成分多、靶點多、作用途徑多的特點，而網絡藥理學融合了系統生物學和傳統醫藥用藥規律原創思路，從“藥物-成分-靶點-疾病”間相互作用的整體性和系統性出發，可以全面系統地預測藏藥在治療疾病中發揮作用的主要成分和發揮作用的具體靶點，成為目前研究民族藥物作用機制的一利器[19]。分子對接通過對靶標蛋白和小分子親和能力的計算，預測蛋白與配體親和能力和結合模式的強有力的工具[20]，可為進一步研究其作用機制提供理論依據。本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法，篩選了藏藥六味木香丸治療胃癌的潛在活性成分和靶點，對六味木香丸的主要化學成分及其治療胃癌的作用機制進行較全面系統地分析，為深入驗證其作用機制提供依據，進一步為新藥研發提供新的途徑和策略。

根據藏醫學“癥-證-病”診斷模式[21]，胃癌可分型為熱型和寒型兩種，是由“三胃火”功能嚴重失調導致，并且具有胃部形成堅硬塊狀病變的表征。六味木香丸在臨床上作為治療胃癌的典型藥物之一，其組方中涼、熱性藥物兼并（如木香、巴夏嘎、余甘子為涼性藥物，石榴子、豆蔻、蓽茇為熱性藥物），故對各類胃癌的早期防止具有潛在作用價值。課題組的前期研究也發現，六味木香丸是治療胃病的核心組方，通過ABL1、F2、ESR1、CYP2C9 等 關 鍵 靶 蛋 白，調 控androgen and estrogen metabolism、cytochrome P450、ErbB 等通路，參與細胞增殖、氧化反應等過程，從多靶點、多通路協同作用，具有遏制慢性萎縮性胃炎發展為癌變的作用[13]。另外，現代研究表明，木香丸作為君藥，含有萜類、生物堿、蒽醌和黃酮等，其中萜類為其主要有效成分，具有抗腫瘤、免疫調節作用[6]；白豆蔻中萜醇類和倍半萜烯類成分含量最高，發現豆蔻的提取物可以有效的抑制胃癌的增殖[22]；余甘子以酚類化合物為主，所含的沒食子酸、槲皮素、鞣花酸的抗氧化性較強，對體液免疫的調節有積極影響。另外，余甘子還富含維生素C 和多酚類物質，臨床試驗發現它們有助于預防亞硝酸鹽攝入引發的癌[23]。蓽茇主要含胡椒堿、四氫胡椒堿等生物堿，還有天門冬氨酸、絲氨酸等多種氨基酸，具有抗胃潰瘍活性。巴夏嘎也稱鴨嘴花，含有鴨嘴花堿，在體外對人肺癌細胞等幾種癌細胞具有明顯的抑制作用，故通過細胞增殖通路發揮抗癌作用；石榴子含有甾類、鞣質、磷脂、三酰甘油等化學成分，其中的石榴酸等可以抑制結腸癌等癌癥的發生[24]，這些實驗結果為六味木香丸治療胃癌提供了重要的科學依據。

本研究最終預測得到六味木香丸對治療胃癌的42 個活性化合物中，槲皮素（quercetin）和木犀草素（luteolin）在余甘子、石榴子和豆蔻中都含有，(+)-兒茶素（(+)-Catechin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、鞣花酸（ellagic acid）、山奈酚（kaempferol）在石榴子和余甘子中都有。通過HPLC 法能夠檢測到六味木香丸中鞣花酸、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香內酯四種成分。胡椒堿僅僅存在于蓽撥中，而鞣花酸存在于石榴子和余甘子中。木香烴內酯和去氫木香內酯是木香的代表性成分。通過TCMSP 數據庫我們發現鞣花酸和胡椒堿的OB值分別為43.06%和42.52%，DL值分別為0.43和0.23；但木香烴內酯的OB 和DL 值分別為29.07%和0.11，不滿足活性成分的篩選條件。去氫木香內酯在TCMSP 數據庫中未檢索到。已經有多個研究報道木香烴內酯和去氫木香內酯能夠通過不同的靶點抑制多種癌細胞的增值，這些結果說明雖然有些活性成分不能滿足口服度等理論篩選指標，但其能表現出很強的特定藥理活性，進一步指示我們今后在收集活性成分中應該從理論篩選和實際實驗報道綜合考慮。此外，我們也發現同一個靶點可以被多個化合物作用，比如，PTGS1 是化合物tetrahydrocoptisine 、quercetin、Pisatin、Pinocembrin、luteolin、kaempferol、Jaranol、Cavidine、Benzo[a]carbazole、7-O-Methyleriodictyol等化合物的共同靶點。這充分體現了藏醫在復方配伍中的獨特之處。靶點MAPK、JUN、STAT3 在網絡中處于核心位置，是六味木香丸對治療胃癌的重要潛在靶點。其中MAPK 是細胞內重要的信號傳遞者，可通過磷酸化核轉錄因子、相關酶類等參與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應、應激反應及免疫防御等多種生物過程；與正?；颊呦啾龋[瘤患者MAPK 家族蛋白表達明顯發生改變，表明MAPK 確實參與了腫瘤的發生與發展。作為第一個被發現的致癌轉錄因子，JUN 蛋白是由原癌基因（c-JUN）編碼產生的蛋白，與病毒癌蛋白v-jun 同源。c-JUN 對紫外線誘導的細胞凋亡有保護作用，并與NF-κB 協同作用抑制了TNF-α 誘導的細胞凋亡。信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）是STAT 家族中的其中一個成員，也是JAK-STAT信號通路的轉錄因子。研究表明，當外界因子作用于STAT3時，STAT3 會被磷酸化，磷酸化的STAT3 是STAT3 的活化形式，會進入到細胞核中，進一步調控靶基因的轉錄和表達。上它的靶蛋白包括基質金屬蛋白酶類2 等。STAT3 在胃癌組織中的表達比正常組織明顯升高，有研究證明STAT3 在胃癌的發生和進展過程中起著顯著的正性調節作用。通過細胞實驗發現，六味木香丸顯著的抑制了胃癌細胞的增殖和STAT3 蛋白的表達，這些結果進一步支持了STAT3 在胃癌中的正調節作用，同時也暗示STAT3 途徑可能是六味木香丸抑制胃癌細胞增殖過程中的重要靶標蛋白之一，這也體現了網絡藥理學預測到結果的可靠性。綜上所述，六味木香丸可能通過胃癌中這些關鍵蛋白進一步影響胃癌的發生和發展。

綜上所述，胃癌的形成與發展是一個由多基因調控、多因素參與、多信號通路交叉作用的復雜過程，其治療至今仍然是一個世界性難題。藏藥復方以其“多成分、多靶點、多途徑”的特點在胃癌防治方面展現出獨特優勢。本研究運用網絡藥理學，分析六味木香丸治療胃癌的有效活性成分、關鍵靶點，為下一步從藥理學角度闡明六味木香丸抗胃癌的具體作用機制提供了目標和思路。