安寐丹調控OXA/CREB/PER1信號通路改善SD模型大鼠晝夜節律紊亂＊

徐 波，謝光璟，夏 婧，王 平

（湖北中醫藥大學老年醫學研究所 武漢 430065）

睡眠充足是國際社會公認的三項健康標準之一，而隨著社會生活節奏的加快，睡眠剝奪（SD）現象持續增加[1]。晝夜節律與睡眠息息相關[2]，調整SD 造成的晝夜節律紊亂是治療失眠的常見方法[3]。近年來，中醫藥防治失眠尤其是中醫古方作用機制研究成為廣大科研工作者的研究熱點。中醫經典名方安寐丹源自清·陳士鐸《石室秘錄》，主治虛證失眠，由人參、生熟棗仁、茯神、當歸等10 味藥物組成。方以人參滋補氣血為君藥，臣以生熟棗仁養血補肝、寧心安神，再以茯神、當歸等補血寧神為佐，共奏補益氣血、養心安神之功。該治法符合近10 年中藥復方治療失眠的用藥規律[4]，乃失眠虛證尤其是中老年失眠患者的常用治療方劑，臨床療效顯著、應用廣泛[5-9]。

前期已有多數文章報道酸棗仁湯[10,11]或酸棗仁-茯苓-黨參等水提物[12,13]防治失眠的作用機制，但關于安寐丹的基礎研究較少報道，筆者前期研究發現該方能改善不同周期SD 模型大鼠的晝夜節律紊亂、學習記憶障礙，其機制可能與調節OXA、OXB 有關[14,15]，但安寐丹防治失眠的深入作用機制暫不明確，進一步探索其作用機制將為安寐丹的臨床運用提供實驗依據。Orexin 是影響睡眠-覺醒的重要因素，Orexin 拮抗劑Suvorexant是目前常用于失眠治療的藥物之一[16]，其效果已經過臨床實驗證實并通過FDA 的批準，為此探討安寐丹對Orexin 的作用可為臨床治療失眠提供新思路，故本實驗擬基于Orexin 信號通路開展安寐丹改善SD 模型大鼠晝夜節律紊亂的作用及相關分子機制研究具有十分重要的研究價值和必要性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

由中國食品藥品檢定研究院供應的健康清潔級6月齡SD 雄性大鼠40 只，許可證號：SCXK（京）2016-0002，動物合格證號：11401500043208。常規適應飼養1 周，使用隨機數字將其分為空白組、模型組、艾司唑侖組、安寐丹組，各10 只；實驗全程遵照《關于善待動物的指導性意見》和相關生物安全制度及相關規章執行。

1.2 造模方法與模型評價

1.2.1 造模方法

采用弱堿性生理鹽水配置PCPA 混懸液，遵循人和動物間體表面積折算的等效劑量比值及預試驗結果，除空白組，余下三組大鼠均按350 mg/kg/天體質量以10 mL·kg-1體積腹腔注射[17]，連續3 天，腹腔注射的同時連續10天疊加國際公認的多平臺水環境剝奪法，以保證造模更加準確。

1.2.2 模型評價

第3 天腹腔注射PCPA 后，將所有大鼠放入ZZ-6自主活動儀（每天光照時間為8:00-20:00點，黑暗時間為20:01-7:59），待其適應環境3 min 后，每隔3 h 記錄大鼠2 min 內的自主活動距離及時間，即分別記錄21:00、00:00、03:00、06:00、9:00、12:00、15:00、18:00時的活動情況，記錄期間保持正常的攝食攝水。若大鼠第3 d腹腔注射PCPA 后24 小時活動距離和活動時間異常，則表明造模成功[18]。

1.3 干預方法及療程

腹腔注射第3 d起開始每日8：00時安寐丹組給予安寐丹水煎劑9.09 mg·kg-1，艾司唑侖組給予艾司唑侖0.09 mg·kg-1灌胃，空白組、模型組給予等容生理鹽水灌胃，1天1次*28天。

1.4 主要藥物與試劑、儀器

1.4.1 主要藥物與試劑

安寐丹：人參11 g，生熟棗仁各19 g，茯神11 g，當歸11 g，丹參7 g，麥冬11 g，五味子4 g，石菖蒲4 g，甘草4 g，購自湖北中醫藥大學附屬黃家湖醫院藥劑室，經湖北中醫藥大學藥學院中藥學鑒定專家鑒定，使用煎藥機煎煮、過濾、濃縮至1:1 比例，冷卻置于4℃冰箱。余下主要藥物試劑如下表1。

表1 主要藥物試劑

1.4.2 主要儀器

主要儀器見下表2.

表2 主要儀器

1.5 療效性指標評價

1.5.1 ZZ-6自主活動儀檢測晝夜節律

方法同1.2.2模型評價。

1.5.2 Morris水迷宮實驗檢測學習記憶

水迷宮分4 個象限，主要分為定位航行試驗和空間探索試驗。定位航行實驗分別從4個象限正中貼壁放入水中，記錄大鼠90 s 內上平臺潛伏期和游泳總路程。空間探索實驗為第6天移除平臺后各組均同一點放入水中，記錄大鼠90 s 跨越原平臺位置的次數和持續時間。

1.5.3 主要檢測方法

免疫熒光檢測下丘腦Orexin 神經元的表達，ELISA 檢測大鼠下丘腦組織OXA、OXB 含量，WB 和RT-PCR 檢測下丘腦組織OXA/CREB/PER1 信號通路蛋白和mRNA表達。

1.6 標本采集及檢測方法

1.6.1 標本采集

各組大鼠干預結束后禁食12 h，麻醉、處死，分組使用灌流法采集下丘腦，生理鹽水沖洗后按組迅速置于液氮中凍存，隨即將標本置于-80℃冰箱保存，待用于后續檢測。

1.6.2 免疫熒光檢測下丘腦Orexin

各組大鼠運用水合氯醛麻醉，開胸，灌流，斷頭，開顱，取出下丘腦組織，用多聚甲醛固定后石蠟包埋。下丘腦切片冠狀切片，凍存，脫蠟至水，漂洗，孵育，加相應指標蛋白的特異性兔抗鼠一抗（1:1000）、羊抗兔二抗（1:200），漂洗并晾干，使用熒光顯微鏡觀察并記錄。

1.6.3 ELISA檢測下丘腦組織OXA、OXB含量

-80℃冰箱取出下丘腦，常溫解凍，組織勻漿機中勻漿，離心取上清，預熱酶標儀，按照試劑盒使用說明依次配置洗滌液等工作液，隨即在96孔板依次加標準品或樣品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液、底物溶液、終止液，測量OD 值，并根據OD 值結果畫出標準曲線，再套用相關公式計算OXA、OXB的含量。

1.6.4 WB 法測定下丘腦區OXA、CREB、PER1 蛋白表達水平

稱取大鼠下丘腦組織，勻漿器勻漿，離心，加PBS，離心，加RIPA 裂解液，離心，提取大鼠下丘腦組織總蛋白，以PBS 緩沖液稀釋后加入96 孔板中，加入BCA工作液，酶標儀測定各孔A562 吸光度，繪制標準曲線并計算各組組織總蛋白濃度。玻璃板加入TEMED 后灌膠裝在電泳槽上，放入電泳盒中，上樣，兩側分別加Prestained protein loading buffer 和Prestained protein MW marker 后電泳。漂洗，切膠，浸泡，轉膜，漂染，漂洗，平鋪于凝膠圖像成像分析儀上，等體積混合Western Blot 超敏發光液，運行Bio-Rad 凝膠圖像成像分析系統，曝光獲得各組蛋白條帶，拍照，分析各組條帶灰度值，并作統計分析。

1.6.5 RT-PCR 法測定下丘腦區OXA、CREB、PER1 mRNA表達水平

-80℃冰箱取出大鼠下丘腦組織，加TRIzol，勻漿，離心，加氯仿，離心，吸上清，加異丙醇、75%乙醇、無RNA 酶水，配制反應混合液與冰上，均量分裝，加total RNA 樣品，充分混勻，設置PCR 儀反應程序為65℃、5 min，4℃、∞；加入5×Prime Script Buffer 2 等，充分混合均勻，設置PCR 儀反應程序為42℃、60 min，70℃、5 min，4℃、∞。配置PCR 反應液，加入PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、DNA 模板、ddH2O 等。充分混合均勻，離心，采用Actin 為內參，設置Real Time-PCR 儀反應條件：96℃、30 min，95℃、5 min，60℃、30 min，95℃、10 min，65℃、5 min，95℃、6 min，共進行40個循環，繪制溶解曲線，采用2-△△ct法計算目的基因相對表達量。引物序列見表3。

表3 引物序列表

△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因

△△Ct=△Ct給藥組-△Ct模型組

1.7 統計學處理采用

2 結果

2.1 24 h內不同時間自主活動距離、時間比較

空白組大鼠24h自主活動時間和距離均呈晝少夜多的節律。與空白組比較，模型組大鼠24 h 自主活動時間和活動距離均高于空白組（P＜0.01），并未呈現出晝夜節律特征（表4、圖1、圖2）。

圖1 24 h內不同時間自主活動距離

圖2 24 h內不同時間自主活動時間

表4 空白組和模型組大鼠24 h內不同時間自主活動距離、時間（ ± s， n=10）

表4 空白組和模型組大鼠24 h內不同時間自主活動距離、時間（ ± s， n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。

組別空白組模型組活動距離（cm）928.56±48.71 1105.96±71.31**活動時間（s）100.81±3.25 115.6±2.67**

2.2 安寐丹對SD模型大鼠學習記憶能力的影響

與空白組比，模型組上平臺潛伏期與游泳總路程均顯著延長（P＜0.01），穿越站臺次數、象限活動時間降低（P＜0.01）；艾司唑侖組和安寐丹組均可減少其上平臺潛伏期（P＜0.01）和游泳總路程（P＜0.01），增加其穿越站臺次數（P＜0.05）和象限活動時間（P＜0.01）。與模型組比較，艾司唑侖組可減少其上平臺潛伏期（P＜0.05）和游泳總路程（P＜0.01），增加其穿越站臺次數（P＜0.05）和象限活動時間（P＜0.01）；安寐丹組可減少其上平臺潛伏期（P＜0.01）和游泳總路程（P＜0.05），增加其穿越站臺次數（P＜0.05）和象限活動時間（P＞0.05）（表5、圖3至6）。

圖3 各組大鼠上平臺潛伏期時間

表5 各組大鼠學習記憶的能力（ ± s，n=10）

表5 各組大鼠學習記憶的能力（ ± s，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾司唑侖組安寐丹組定位航行實驗上平臺潛伏期（s）25.53±8.71 53.64±5.43**46.94±7.28**△40.65±6.34**△△游泳總路程（cm）333.03±44.01 989.41±41.98**643.73±34.16**△△862.74±33.78**△空間探索實驗穿越站臺次數3.5±0.82 1.33±0.47**2.67±0.55*△2.33±0.52*△象限活動時間（s）33.92±4.05 14.74±4.24**21.39±5.60**△△15.32±2.76**

2.3 安寐丹對SD 模型大鼠下丘腦Orexin 含量的影響

2.3.1 ELISA檢測結果

與空白組比較，SD 大鼠下丘腦組織OXA、OXB 均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，艾司唑侖組可顯著降低OXA和OXB含量（P＜0.01）；安寐丹組可顯著降低OXA 含量（P＜0.01）和OXB 含量（P＜0.05）（表6、圖7、圖8）。

圖8 各組大鼠下丘腦OXB含量的表達

表6 各組大鼠下丘腦組織OXA、OXB含量表達（ ± s，n=10）

表6 各組大鼠下丘腦組織OXA、OXB含量表達（ ± s，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾司唑侖組安寐丹組OXA（pg·μL-1）2855.50±142.96 3790.70±104.91**3380.95±105.63**△△3567.60±128.17**△△OXB（pg·μL-1）3643.55±118.36 3930.45±104.91**3745.70±151.14**△△3926.00±108.12**△

圖7 各組大鼠下丘腦OXA含量的表達

2.3.2 免疫熒光檢測結果

如圖所示，SD 大鼠下丘腦區OX 含量較空白組增多，艾司唑侖組和安寐丹組與模型組相比OX 含量呈不同程度下降（圖9）。

圖4 各組大鼠游泳總路程

圖5 各組大鼠穿越站臺次數

圖6 各組大鼠象限活動時間

圖9 各組大鼠模型下丘腦區OX免疫熒光圖（400×）

2.4 WB檢測結果

與空白組比較，模型組下丘腦組織OXA、CREB 蛋白表達均上調（P＜0.01）、PER1 蛋白表達下調（P＜0.01），艾司唑侖組下丘腦組織OXA、CREB 蛋白表達均上調（P＜0.05）、PER1 蛋白表達下調（P＜0.05），安寐丹組下丘腦組織OXA 蛋白相對表達上調（P＜0.01）、CREB 蛋白相對表達上調（P＜0.05）、PER1 蛋白表達下調（P＜0.01）。與模型組比較，艾司唑侖組下丘腦組織OXA蛋白表達下調（P＜0.05）、CREB蛋白表達下調（P＜0.01），PER1 蛋白表達上調（P＜0.01），安寐丹組下丘腦組織OXA 蛋白表達下調（P＜0.05）、CREB 蛋白表達下調（P＜0.01）、PER1 蛋白表達上調（P＜0.01）（表7、圖10-13）。

圖10 各組大鼠OXA、CREB、PER1蛋白WB結果

表7 各組大鼠下丘腦OXA、CREB、PER1蛋白的表達（ ± s，n=10）

表7 各組大鼠下丘腦OXA、CREB、PER1蛋白的表達（ ± s，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾司唑侖組安寐丹組OXA 0.78±0.03 1.01±0.08**0.85±0.07*△0.87±0.04**△CREB 0.10±0.01 0.25±0.03**0.17±0.06*△△0.22±0.05*△△PER1 0.17±0.01 0.06±0.03**0.10±0.04*△△0.09±0.01**△△

圖11 各組大鼠OXA蛋白表達

圖12 各組大鼠CREB蛋白表達

2.5 RT-PCR檢測結果

圖13 各組大鼠PER1蛋白表達

與空白組比較，模型組OXA、CREB mRNA 表達均上調（P＜0.01），PER1 mRNA 表達均下調（P＜0.01）；艾司 唑 侖 組OXA mRNA 表 達 上 調（P＜0.05）、CREB mRNA 表達上調（P＜0.01），PER1 mRNA 表達下調（P＜0.01）；安寐丹 組OXA mRNA 表達 上 調（P＜0.01）、CREB mRNA 表達上調（P＜0.05），PER1 mRNA 表達下調（P＜0.01）。與模型組比較，艾司唑侖組OXA mRNA表達下調（P＜0.01）、CREB mRNA 表達下調（P＜0.01），PER1 mRNA 表 達 上 調（P＜0.05）；安 寐 丹 組OXA mRNA 表達下調（P＜0.01），CREB mRNA 表達下調（P＜0.05），PER1 mRNA 表 達 上 調（P＜0.05）（表8、圖14-16）。

表8 各組大鼠下丘腦OXA、CREB、PER1 mRNA的表達（ ± s，n=10）

表8 各組大鼠下丘腦OXA、CREB、PER1 mRNA的表達（ ± s，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾司唑侖組安寐丹組OXA 0.83±0.12 1.00**0.96±0.13*△△0.98±0.14**△△CREB 0.42±0.13 1.00**0.55±0.13**△△0.47±0.11*△PER1 1.71±0.28 1.00**1.15±0.13*△1.38±0.19**△

圖14 各組大鼠OXA mRNA表達圖

4 討論

本次實驗采用國際公認的PCPA 腹腔注射以及改良多平臺水環境法進行造模。PCPA 作為國際公認的SD模性，具有操作簡單、成模時間短、可重復性高等特征，廣泛應用于失眠的研究，是失眠機制研究中應用最廣泛的模型[19]，腹腔注射PCPA 可使晝夜節律紊亂、白晝睡眠行為幾乎消失，以此表明造模成功[20]。本研究運用ZZ-6 自主活動儀對比空白組和模型組24h 自主活動時間和距離發現，空白組大鼠“晝伏夜出”的節律明顯，具體表現為白天活動時間和距離少，夜間活動時間距離長；而SD 大鼠24h活動時間和活動距離喪失“晝伏夜出”的節律而呈現24 h“持續躁動”的節律紊亂的現象，說明造模成功。

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

圖15 各組大鼠CREB mRNA表達圖

SD、晝夜節律和學習記憶三者息息相關，學習記憶包括信息獲取、編碼、短時儲存、長期鞏固及記憶提取等復雜的過程，最新研究表明失眠相關的日間認知障礙很可能是由于認知控制受損[21]，進一步研究發現，SD損害學習記憶的病理機制常涉及到突觸可塑性、晝夜節律、內質網應激以及能量代謝等方面的改變[22]，分子機制主要包括損害長時程增強、改變谷氨酸受體表達和功能、改變節律基因表達和翻譯過程、損害海馬的神經發生、改變OX 系統等[23-24]。本次實驗結果表明PCPA 所致晝夜節律紊亂的SD 大鼠上平臺的潛伏期和游泳總路程均高于空白組、穿越站臺次數和象限活動時間均低于空白組，說明SD 導致大鼠晝夜節律紊亂后會使大鼠學習記憶能力降低；而安寐丹可以降低其上平臺的潛伏期、縮短其游泳總路程，增加其穿越站臺次數和象限活動時間，從而改善其認知受損，但是否能改善其晝夜節律紊亂尚不得而知。

晝夜節律是睡眠產生的重要生理基礎，位于下丘腦的視交叉上核（SCN）可根據環境明暗獨自產生并維持機體的日周期節律，是人類晝夜節律起搏器，是控制晝夜節律的關鍵部位，被稱作“大腦中的主控時鐘”。中醫稱“腦為元神之腑”“腦主神明”，具有主宰精神、意識、思維功能，為精神、意識、思維活動的樞紐；而SCN 的重要作用則進一步豐富和闡釋了“腦為元神之腑”“腦主神明”的中醫內涵。進一步研究發現，SCN 損傷的大鼠24h 晝夜節律消失、記憶下降，生物鐘基因也發生相應改變[25]。晝夜節律相關基因有生物鐘基因Clock、時鐘管理基因Bmal1、系列周期基因Per1、Per2、Per3 以及晶體蛋白基因Cry 1、Cry2 等；而PER 基因最早被復制和鑒定且在SCN 中表達明顯[26]，大鼠的PER mRNA 表達具有夜晚高早晨低的節律變化[27]，將PER 基因導入PER 基因突變的果蠅可恢復其晝夜節律[28]；哺乳動物PER 基因有PER1、PER2、PER3三個亞型，PER1、PER2亞型是維持和調控晝夜節律的核心基因，且其中樞調節點位于SCN 上[29]，而PER1 亞型又可以調控其他鐘基因如PER2、PER3、CRY1、CRY2 等表達[30]，晝夜節律紊亂會導致PER1 mRNA 表達下降[31]。研究還發現，光信號主要是通過啟動CREB 的轉錄激活通過視網膜-下丘腦通路傳給SCN，增加PER1表達，即光誘導CREB/PER1信號通路[32]。

Orexin是下丘腦分泌的具有促進和興奮作用的神經元，包括OXA 和OXB，在睡眠狀態下OX 神經元處于相對靜息狀態，在清醒狀態下OX 神經元激活并且腦脊液中OX 的含量明顯升高[33]。包含Orexin 受體-1（Orexin Receptor-1, OX1R）和Orexin 受體-2（Orexin Receptor-2, OX2R），且OX1R 與OXA 的親和力高于OXB[34]；當Orexin被激活時，OX1R活化會導致Gq/磷酸酯酶C（Phospho lipase C，PLC）/蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）途徑激活，進而調節離子通道活性、細胞去極化、增加胞漿中鈣離子濃度以增強信號在突觸間傳導，進一步上調CREB 等激酶，最終調節相關的生理學功能[35]。由前文可知PER1 在晝夜節律系統中處于核心地位，而光信號經視網膜細胞傳遞給SCN 導致mPER1 基因的表達主要是通過啟動子上的CREB 的轉錄激活實現的，即Orexin/CREB/PER1信號通路。進一步研究發現SCN調控著PER1基因[36]，SCN 損毀的大鼠體內Orexin 分泌晝夜節律紊亂[37]，研究亦發現SCN區的PER1-增強綠色熒光蛋白（PER1-Enhanced Green Fluorescent Protein，PER1-EGFP）神經元被OXA纖維包圍，而Orexin 可抑制PER1-EGFP 的時鐘細胞表達，闡明Orexin 可通過反向調控SCN 區節律基因PER1 來改善睡眠[38]。因“腦為一身之宗，百神之會”，可以調節機體各類氣血津液，衛氣亦不例外，故SCN調控PER1 基因影響睡眠隸屬于中醫“腦主神明”的范疇。

Orexin 雖在下丘腦產生，但廣泛分布于外周系統并參與眾多生理活動，中藥可以通過調節Orexin 神經元或其受體改善模型動物的相關病理現象，如研究發現疏肝和胃湯可能通過調節Orexin 及其受體改善抑郁模型大鼠胃排空延遲[26]；寧心方加減可調節神經遞質OXA 的表達而改善睡眠質量[39]；天王補心丹可調節OXA信號保護慢性SD小鼠糖脂代謝異常[40]；鎮驚溫膽湯可以調控大鼠Orexin 系統及其受體緩解不寐、善驚等病理狀態[41]。本實驗免疫熒光和Elisa 結果均表明SD 模型大鼠下丘腦區Orexin、OXA、OXB 含量均增多，而艾司唑侖組和安寐丹組可降低其含量；WB 結果進一步表明模型組大鼠下丘腦組織OXA、CREB 蛋白表達均上調、PER1 蛋白表達下調，而艾司唑侖組和安寐丹組大鼠下丘腦組織的OXA、CREB 蛋白表達均下調，PER1 蛋白表達上調；RT-PCR 再次佐證SD 大鼠下丘腦區的OXA mRNA、CREB mRNA 表達上調、PER1 mRNA 表達下調，而艾司唑侖、安寐丹可降低SD 大鼠下丘腦區的OXA mRNA、CREB mRNA 表達，上調其PER1 mRNA表達，從而改善SD模型晝夜節律紊亂，說明艾司唑侖、安寐丹可能是通過調節Orexin 及其介導的OXA/CREB/PER1 信號通路而發揮作用。且單從行為學和RT-PCR 實驗數據上看，艾司唑侖組增多SD大鼠穿越站臺次數和象限活動時間，降低下丘腦組織OXA、OXB含量，下調下丘腦組織OXA mRNA 表達，上調PER1 mRNA 表達均優于安寐丹；而安寐丹在降低SD 上平臺潛伏期、下調下丘腦組織CREB mRNA 表達優于艾司唑侖，說明二者在改善SD 導致的學習記憶障礙和節律紊亂各有優勢。該研究結果較充分闡明了安寐丹基于“腦主神明”的理論指導防治失眠的物質基礎與Orexin息息相關。

綜上所述，安寐丹能夠改善SD 模型大鼠的晝夜節律紊亂及學習記憶，其作用途徑可能與調節Orexin及其介導的OXA/CREB/PER1 信號通路相關，但其深入機制尚需展開進一步研究。