藏藥二十五味珊瑚丸對阿爾茨海默癥小鼠腸道菌群的調節(jié)＊

角加才仁，仲格嘉，李宏紅，胡賢達，韓亞南，陳茜茜，吳金鵬＊＊，陰慧娟

（1.中國藏學研究中心北京藏醫(yī)院 北京 100029；2.中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所激光醫(yī)學實驗室 天津 300192）

1 引言

阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD），俗稱老年癡呆（占所有癡呆患者的60%-80%），是一種典型的中樞神經(jīng)退行性病變，患者主要表現(xiàn)為認知功能障礙、記憶力逐漸衰退、行為異常及社交障礙等，直至癡呆[1]。《2018年全球阿爾茨海默病報告》指出AD 是人類的問題，也是一個全球性的問題。全球每3 秒鐘就將有1 例癡呆患者產(chǎn)生。AD 病理特征是患者大腦中出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β, Aβ）聚集形成的老年斑、tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結、神經(jīng)元及突觸的功能失調以及大腦中的長期慢性炎癥，最終發(fā)生退行性病變等。目前除傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質類藥物如美金剛等有限改善一些表面癥狀外，其他藥物開發(fā)無一成功，AD的治療陷入困境。

近年來的研究表明，腸道菌群通過多種途徑參與AD 的發(fā)生和發(fā)展，被認為是AD 治療的新靶點[2]。腸道菌群主要通過神經(jīng)、內分泌、代謝和免疫等途徑影響AD 的發(fā)生[2-3]。老年患者腸壁變薄，腸道菌群多樣性發(fā)生變化，有益菌群和有害菌群比例失調，產(chǎn)生諸如細菌Aβ、脂多糖、乙酰膽堿、5-羥色胺、短鏈脂肪酸等物質，不僅激活免疫細胞，加重神經(jīng)炎癥，還使腸道屏障和血腦屏障功能進一步受損[4]。研究表明腸道菌群調節(jié)（益生元、益生菌、糞菌移植等方法）對阿爾茲海默癥認知能力和Aβ 淀粉樣沉積有改善作用[5-7]。Wang 等發(fā)現(xiàn)糞菌移植可使3 月齡APPSWE/PS1ΔE9小鼠Aβ 斑塊周圍由小膠質細胞引起的炎癥活動增強，而小膠質細胞是Aβ斑塊清除的主要細胞[8]。伊朗的1項隨機雙盲對照實驗表明AD患者服用12周益生菌和硒補充劑能有效提高患者認知能力和包括抗氧化能力等在內的代謝水平[9]。

二十五味珊瑚丸（ershiwuwei coral pill,CP25）有活血化瘀、消炎止痛、安神鎮(zhèn)靜等療效，在藏藥中被用于治療“白脈病”，也就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10]，如頭痛、癲癇、中風等[11-13]。CP25 含有25 種植物藥材和礦物質成分，Ying等的論文中給出了CP25的配方[14]。研究發(fā)現(xiàn)25 種成分中，訶子（Terminalia chebula Retz）提取物具有抗氧化作用[15]；紅花（Carthamus tinctorius）提取物具有改善血液循環(huán)和抗血栓形成作用，同時還具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用[16]；甘草（glycyrrhiza）代謝物具有抗炎、抗菌和降血脂作用，對神經(jīng)[10]細胞凋亡有保護作用[17]；獐牙菜（Swertia bimaculata(sieb.Et zucc.)hook.f.et thoms）能顯著抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還具有保護胃腸道、抗炎和抗菌等作用[18]；沉香具有明顯的降血壓作用[19]；藏菖蒲（Acorus calamus L.）對中樞神經(jīng)有雙向調節(jié)作用，既有興奮也有抑制作用[20]；紅珊瑚、珍珠等礦物質含有磷酸鈣，對治療腦缺血有明顯作用[21]；其他礦物質含有人體必需的常量元素和微量元素，對神經(jīng)保護、神經(jīng)活動的調節(jié)和抗炎鎮(zhèn)痛都有積極的作用[22-23]。

為了探索CP25 在治療阿爾茲海默癥上的可能性，本團隊在前期不但對二十五味珊瑚丸的毒理學及主要指標成分的含量進行了詳細的分析[24]，而且對其中的神經(jīng)保護作用物質進行了分析[25]，同時采用網(wǎng)絡藥理學方法，對前期鑒別出的35種入血成分進行了潛在靶點預測，結果顯示CP25 可通過多組分和多靶點的協(xié)同作用，共同干預阿爾茲海默癥的進程[26]。雖然這些研究都表明CP25 可能是一種潛在的治療阿爾茲海默癥的良藥，但還缺乏直接的實驗證據(jù)。通過上述研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂通過神經(jīng)、內分泌、代謝和免疫影響AD 的進展，而CP 25 具有明確的抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護作用[14-23]，因此口服CP25 有可能通過改善腸道菌群紊亂造成的炎癥、神經(jīng)損傷和免疫異常而促進AD的恢復。為了探索該問題，本研究通過APP/PS1雙轉基因AD 小鼠和A?1-42誘導的AD 小鼠兩種動物模型，觀察口服CP25 對AD 小鼠腸道菌群的調節(jié)，及對阿爾茲海默癥的治療作用，為民族醫(yī)藥對AD 的治療提供實驗證據(jù)。

本研究是北京藏醫(yī)院承擔的國家財政部專項撥款的十三五項目-心腦血管臨床和民族醫(yī)技醫(yī)法傳承及新藥研究的重要組成部分，AD 作為心腦血管疾病的一種老年慢性疾病，已經(jīng)嚴重影響國民的健康，在目前無有效治療藥物的困境下，二十五味珊瑚丸作為藏醫(yī)治療白脈病的一線藥物，而上述分析提示二十五味珊瑚丸可能具有干預AD 的潛能。為此，本研究采用兩種經(jīng)典的AD 模型小鼠探索二十五味珊瑚丸是否具有干預AD 的作用，同時研究腸道菌群在這個過程中可能的作用機制。以期通過該研究，為推進CP25用于干預AD的臨床進程提供數(shù)據(jù)支撐。。

2 材料與方法

2.1 材料

二十五味珊瑚丸（CP25）（金訶藏藥股份有限公司生產(chǎn)，每丸重0.25 g，每盒兩版，共24 丸，批準文號：國藥準字Z63020059，生產(chǎn)批號：01180510），Amyloid Beta-Peptide (1-42) (human) 蛋 白（Sigma，0.1mg,A9810），Rabbit-anti-beta Amyloid1-42（英國Abcam 公司，批號ab224025），羊抗兔IgG-TRITC（美國Jackson Immuno Research 公司，批號111-025-003），Morris 水迷宮（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，ZS-001 moriss）。

2.2 方法

2.2.1 AD動物模型

APP/PS1雙轉基因AD 小鼠（Mt）：60只雄性6月齡的APP/PS1 雙轉基因AD 小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司（生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2014-0004，實驗動物質量合格證號：11401300093230）。雙轉基因APP/PS1 小鼠AD 小鼠可表達突變的人類早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉樣前蛋白（APPswe）融合體，雙轉基因APP/PS1小鼠這兩個基因的表達都由小鼠朊病毒蛋白啟動子啟動。人類早老素基因的DeltaE9 突變是該基因的第九個外顯子缺失產(chǎn)生的，此突變會導致早發(fā)性老年癡呆癥。試驗動物隨機分為4 組，每組15只。

A?1-42誘導AD 小鼠（Mi）：85 只雄性12 周齡的C57BL/6N 野生型正常小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0006，實驗動物質量合格證號：1100111911000703）。C57BL/6N 小鼠 由C.C.Little 對Miss Abby Lathrop 品 系交配繁育而成，維通利華從Charles River 引入第83 代核心群，對該品系進行Cloneback，毛發(fā)為黑色（MHC單體型H2b,品系代碼213）。其中70只用于A?1-42誘導AD小鼠造模。方法：1 mg A?1-42蛋白先用20 μL DMSO充分溶解后，用PBS 稀釋10 倍，濃度為5 g·L-1，置于37℃細胞培養(yǎng)箱孵育4天，使其變?yōu)槟蹜B(tài)，用于誘導AD 小鼠模型。小鼠麻醉后，固定于腦立體定向儀，暴露Bregrna（前囟）點，以雙側海馬CA1 區(qū)為給藥點，在前囟后2.3 mm，矢狀縫兩側旁開1.8 mm 處，注射1 μL A?1-42溶液（濃度5 g·L-1）。進針深度2.0 mm，速度1 mm·min-1，注射速度為0.2 μL·min-1，留針5 min。術后第8 天進行行為學檢測，造模成功的A?1-42誘導AD 小鼠隨機分為4組，每組平均15只。另有15只C57BL/6J野生型正常小鼠作為空白對照組（Ctrl-B）。

所有動物實驗在中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心P2級動物飼養(yǎng)室進行，飼料和飲水均為清潔級。實驗方法和操作符合動物保護、動物福利和倫理原則，符合國家實驗動物福利倫理的相關規(guī)定，并經(jīng)中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物倫理委員會審核通過（倫理審批編號：IRM-DWLL-2019127）。

2.2.2 CP25給藥

CP25 在熱水中浸泡過夜，充分攪拌至混懸均勻，配置成濃度為20 g·L-1的母液備用。兩種AD 模型小鼠（Mt 和Mi）都分為4 組，模型對照組和3 組不同劑量的CP25 給藥組。CP25 給藥劑量分別為每天100 mg·kg-1體重（分別為tCP25-100 和iCP25-100 組）、200 mg· kg-1體重（分別為tCP25-200 和iCP25-200 組）、400 mg· kg-1體重（分別為tCP25-400 和iCP25-400組），灌胃給藥，每天1 次，每周給藥5 天，間歇2 天，連續(xù)8周。對照組給予同樣體積的生理鹽水灌胃。

2.2.3 模型驗證與行為學檢測

CP25 給藥前將Mt 和Mi 模型小鼠與正常小鼠各隨機抽取6 只進行模型驗證，采用Morris 水迷宮分別進行定位航行和空間探索實驗檢測AD 小鼠的學習能力和記憶能力等行為學表現(xiàn)。在定位航行前對AD 小鼠進行3 天的訓練，幫助小鼠找到平臺并在平臺停留120 s 以上。定位航行：在水迷宮4 個象限中的其中一個放入平臺，將小鼠從對面象限放入水中，采用數(shù)字追蹤系統(tǒng)記錄小鼠爬上平臺前的潛伏期、游泳速度和游泳軌跡，軟件分析搜索策略并計算評分。每天2次，連續(xù)記錄6天。空間探索：將平臺從水迷宮中拿走，小鼠從任意象限放入水中，記錄2 min 內小鼠穿越平臺象限的次數(shù)、在平臺象限游泳的時間以及游泳軌跡。進行模型驗證的小鼠不再納入實驗，避免因訓練造成對后續(xù)效果測試的影響。以與對照組相比潛伏期有明顯差異（P＜0.05）為模型成功的判斷標準。CP25 給藥8 周結束后采用同樣的方法進行AD 小鼠的學習能力和記憶能力等行為學檢測。

2.2.4 病理檢測

水迷宮檢測結束后，小鼠在深度麻醉（按0.5 mL/100 g 劑量腹腔注射5%水合氯酸溶液）下，心腔灌注冷生理鹽水20 mL，10 min 內取全腦和糞便組織等樣品。腦組織用于冷凍切片制備，快速取全腦，梯度蔗糖脫水，OCT 包埋，快速冷凍，沿冠狀面切片（厚度5 μm）備用。后者小心剝離海馬組織，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎弥苽涞睦鋬銮衅M行A?1-42、免疫熒光染色以觀察AD 小鼠在給藥后淀粉樣斑塊的改善。Rabbit-antibeta Amyloid 1-42 稀釋比例為1:100，二抗羊抗兔IgGTRITC 稀釋比例為1:100,Ex/Em=550/570 nm。采用全自動掃片系統(tǒng)（C13210-01，日本濱松光子學株式會社）獲取免疫熒光圖像，采用ImageJ 軟件對A? 斑塊數(shù)量進行計數(shù)。

2.2.5 腸道菌群檢測

糞便組織取自結腸，小心分離結腸全段，一端切口，從另一端開始向下擠出糞便樣品，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎?6S RNA 測序法進行AD 小鼠腸道菌群多樣性檢測。冷凍保存的新鮮糞便采用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，每組5 個糞便樣品。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度。取適量的樣品到離心管中，在無菌水中稀釋至1 ng·μL-1，以稀釋后的基因組DNA 為模板，以16S V3-V4 區(qū)為測序區(qū)域，使用帶Barcode 的特異引物，引物343F(5’- tacggraggcagcg -3’) 和798R(5’- AGGGTATCTAATCCT-3’)，采 用Takara Ex Taq 高保真酶進行PCR（Bio-rad,CA,USA）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，磁珠純化，并以此為模板進行二輪PCR 擴增。再次檢測純化，Qubit 定量。最后，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等量混樣，并在Illumina-MiSeq（Cal.，USA）機上測序。使用Trimmomatic 軟件對原始雙端序列（FASTQ格式）進行去雜。當質量低于20時，截獲前面高質序列。生成優(yōu)質序列后，使用Vsearch軟件根據(jù)序列的相似性將序列歸為為多個OTUs。序列相似度大于或等于97%被歸為1 個OTU 單元。使用QIIME 軟件包挑選出每個OTU 的代表性序列，將所有的代表性序列與Silva（version132）數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結果。

2.2.6 統(tǒng)計分析

所有計量均用xˉ±S表示，兩組間比較采用雙尾t檢驗，兩組以上比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示顯著統(tǒng)計學差異。Originlab2018被用于進行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。

3 結果

3.1 行為學改善與A?斑塊

我們采用水迷宮法檢測了兩種AD 小鼠（APP/PS1雙轉基因AD 小鼠Mt 和A?1-40 誘導的AD 小鼠Mi）在CP25 給藥后的行為學改變。定位航行實驗檢測小鼠的學習能力，如圖1A 所示，在連續(xù)6 天的定位航行實驗中，兩種不同AD 模型小鼠—Ctrl-Mt 和Ctrl-Mi 的潛伏期（找到平臺所用時間）均較高于對照組Ctrl-B（P＜0.05），說明AD 小鼠的學習能力顯著低于正常小鼠。給予8 周的CP25 治療后，Mt 和Mi 小鼠的學習能力均得到明顯的提升。以第6天為例，Mt小鼠CP25給藥組中低劑量組（tCP25-100 and-200）的潛伏期恢復到正常小鼠水平（P＜0.05），高劑量組效果不明顯（P＞0.05）。而Mi 小鼠中，3 個劑量組均顯著改善，組間無顯著差異（P＞0.05）。同時我們還采用空間探索實驗檢測小鼠的記憶能力，Mi模型給藥組中行跡路線圖有明顯的平臺趨向性，如圖1B、表1所示，統(tǒng)計結果也表明CP25給藥可明顯改善Mi 小鼠的記憶能力，但對Mt 小鼠無顯著影響。

圖1 CP25給藥對兩種AD小鼠行為學和病理學的改變

表1 兩種模型小鼠空間探索能力（n=15）

Aβ 斑塊是AD 重要的病理表現(xiàn)之一。如圖1C 所示，對于基因型小鼠，與對照組相比，tCP25-200 組小鼠大腦皮質和海馬區(qū)的Aβ 斑塊無顯著差異（P＞0.05），說明CP25 給藥不能消除或減輕APP/PS1 雙轉基因AD 小鼠即Mt 小鼠的Aβ 蛋白沉積。而對于誘導型AD 模型（Ctrl Mi），Aβ 斑塊密集分布于誘導給藥針頭位置，如圖1C 左下圖所示；CP25 給藥組（iCP25-200）未發(fā)現(xiàn)Aβ 斑塊，分析可能CP25 治療起作用，也可能是腦片未切到合適位置。

3.2 腸道菌群

本實驗通過檢測CP25 口服給藥對腸道菌群多樣性的影響，嘗試解釋CP25 改善AD 小鼠行為學和病理學的效應機制。為避免環(huán)境和飲食因素對腸道菌群的影響，所有實驗動物均在同一飼養(yǎng)室進行相同食水飼養(yǎng)。結果如圖2 所示，CP25 給藥對腸道菌群門類別上的豐度有明顯的影響。與正常小鼠相比（Ctrl B，圖2A），兩種AD模型小鼠腸道菌群在門類別上的豐度變化明顯不同（圖2C-J）。基因模型（Ctrl Mt，圖2C 第一個餅圖）小鼠厚壁菌門豐度下降，而擬桿菌門豐度上升；誘導模型（Ctrl Mi，圖2G）正好相反，且變化幅度顯著。CP25給藥可糾正兩種AD模型腸道菌群在門類別豐度上的異常。對于基因模型（Ctrl Mt）小鼠，中高濃度給藥逆轉厚壁菌門和擬桿菌門的相對比例效果更加明顯（圖2 E-F））；對于誘導模型（Ctrl Mi），3 種濃度CP25 給藥都顯著逆轉了異常的厚壁菌門和擬桿菌門比例（圖2 H-J）。這些結果表明CP25 給藥對腸道菌群有顯著影響。一般認為厚壁菌門多為有益菌，擬桿菌門多為有害菌。CP25 給藥能夠顯著提高基因型小鼠厚壁菌門和擬桿菌門比例，促進有益菌增加，提示可能CP25可糾正腸道菌群的紊亂。

圖2 CP25給藥對腸道菌群在門類別上豐度的影響

采用Kruskal-Wallis 檢驗分析組間Alpha 多樣性指數(shù)差異是否顯著。以Observe、Chao1、Shannon 和Simpson's 指數(shù)為例，組間差異分析的箱形圖如圖3A所示。對于基因模型小鼠，Observe、Chao1 指數(shù)顯示，其與對照組有明顯的差異，說明基因模型小鼠腸道菌群有明顯紊亂。CP25 給藥后，3 個濃度間，CP25-100與CP25-400 間差異最為顯著。而誘導模型小鼠與正常小鼠腸道菌群無明顯的改變，表明急性誘導AD 模型小鼠的腸道菌群沒有受到顯著影響，AD 患者的腸道菌群紊亂是一個長期的過程。然而，CP25-100給藥對這種模型小鼠的正常腸道菌群仍然有顯著的影響。

圖3 CP25給藥對于組間腸道菌群多樣性分析

為了進行多樣本間的比較，本研究進行了PCoA分析，即主坐標分析，并基于Bray-Curtis 距離矩陣進行PCoA 作圖，如圖3B 所示。基因模型小鼠與正常小鼠分為兩個明顯的分離的群，CP25-200 和CP25-400的群與正常小鼠重合，CP25-100位于基因模型小鼠與正常小鼠的群之間。表明CP25 給藥，特別是中高劑量給藥，能顯著地糾正基因模型小鼠的腸道菌群紊亂。而誘導模型小鼠和正常小鼠的群部分重疊，表明誘導模型小鼠的腸道菌群沒有受到明顯的影響，CP25給藥的3個劑量組的群與誘導模型小鼠和正常小鼠的群重疊，表明CP25給藥對正常菌群沒有負向影響。

使用R 軟件DESeq2 程序包，基于wald 檢驗方法，進行差異菌群篩選，并以屬類別P＜005的前10個細菌屬別進行作圖，如圖4 所示。對于基因模型小鼠，CP25 給藥不同劑量分別對脫硫弧菌屬Desulfovibrio（上調）、乳桿菌屬Lactobacillus（下調）、普雷沃氏菌科PrevotellaceaeGa6A1_group（上調）、瘤胃梭菌屬Ruminiclostridium_9（下調）和不可培養(yǎng)擬桿菌屬uncultured_Bacteroidales_bacterium（下調）有糾正性調節(jié)，其中CP25-200 調節(jié)作用作為最為顯著，CP25-400次之，CP25-100 作用最弱。而對于誘導模型小鼠，CP25 給藥下調Acetatifactor和腸桿菌屬Enterorhabdus，上調醋香腸菌屬Acetitom aculum、梭菌ASF356、毛螺菌屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、脫鐵桿菌屬Mucispirillum、毛螺旋菌屬Parasutterella、普雷沃菌屬Prevotella_1、普雷沃菌屬Prevotella_9、普雷沃氏菌科PrevotellaceaeGa6A1_group 等。 其 中 腸 桿 菌 屬Enterorhabdus為糾正性調節(jié)。在兩種模型鼠中，CP25給藥均對脫鐵桿菌屬Mucispirillum有上調作用。

圖4 兩種不同AD模型中以屬為類別的前10差異菌群

4 討論

為了探索藏藥CP25 對阿爾茲海默癥患者腸道菌群的影響，本實驗采用了兩種AD 小鼠模型，APP/PS1雙轉基因小鼠（Mt）和A?1-40 誘導的AD 小鼠（Mi）。Aβ1-40 誘導的AD 小鼠（Mi）是由海馬CA1 區(qū)直接注射Aβ1-40蛋白，短期內形成的AD 模型。這種模型是由單一因素-beta 淀粉樣斑塊造成的，且成模時間短，不足以對腸道菌群形成逆向影響。APP/PS1雙轉基因小鼠（Mt）可表達突變的人類早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉樣前蛋白（APPswe）融合體[27]，6-7 月齡即可在小鼠腦內形成Aβ 淀粉樣斑塊，如我們在實驗中檢測到的一樣（圖1），Aβ 淀粉樣斑塊在小鼠海馬和皮層無規(guī)則散在分布。同時由于成模時間長，Mt小鼠的腸道菌群多樣性與正常小鼠呈現(xiàn)明顯的不同。本實驗采用誘導性和基因型AD 小鼠模型來觀察CP25 給藥對腸道菌群的影響，對比分析腸道菌群在CP25 治療AD 過程中的影響，從兩個角度來驗證CP25 對腸道菌群的改變與AD改善之間的關系。

通過對兩種模型小鼠進行長達8 周的CP25 口服給藥，我們發(fā)現(xiàn)CP25 能有效改善Mt 和Mi 小鼠的學習能力，但對A?斑塊無明顯的清除作用，提示A?蛋白的清除不是CP25的直接靶點。目前臨床上尚無針對A?蛋白的藥物面市，但是處于研發(fā)階段的作用于A? 蛋白的藥物很多，主要分為三類：抑制Aβ 蛋白合成（如verubecestat[28]、lanabecestat[29]和E-2609[30]等）、抑制A?蛋 白 聚 集（ 如 PBT2[31]）、抗 Aβ 抗 體（ 如Bapineuzumab[32]）。其中抑制A? 蛋白聚集主要應用金白的聚集[33]。CP25 含有多種礦物質，我們預期CP25可能會通過金屬螯合劑清除A? 蛋白，然而結果顯示并不能有效清除Aβ 淀粉斑塊，分析其原因可能是CP25 中的礦物質不能有效通過血腦屏障達到病變部位屬合劑干擾Aβ 與金屬離子的相互作用，從而減少毒性Aβ 蛋白的聚集[33]。CP25 含有多種礦物質，我們CP25可能會通過金屬螯合劑清除Aβ蛋白，然而Aβ淀粉斑塊，分析其原因CP25 中的礦物質不能有效通過血腦屏障達到病變部位。

我們在前期實驗中已經(jīng)對分析出的CP2535 個入血成分采用網(wǎng)絡藥理學分析法進行預測，發(fā)現(xiàn)了針對AD可能有78個潛在靶點，對應的生物學功能主要有3類，包括Aβ 淀粉樣斑塊的清除、炎癥與免疫、凋亡與自噬[26]。通過Mt和Mi模型小鼠行為學和病理學結果，我們推測CP25 的入血成分很少能通過血腦屏障進入腦區(qū)，腸腦軸可能是其作用路徑。

CP25為口服給藥，胃腸道是其藥物吸收的第一道屏障。腸道菌群通過多種途徑參與AD 的發(fā)生和發(fā)展，被認為是AD 治療的新靶點[34]。CP25 具有活血化瘀、消炎止痛的作用，對于炎癥有正向調節(jié)作用，AD患者腸道菌群失調也和炎癥密切相關。在長期CP25給藥過程中，腸道菌群是否受到有益調節(jié)是值得關注的問題。研究表明，AD 患者的腸道菌群多樣性明顯下降，厚壁菌門和雙歧桿菌屬豐度降低，擬桿菌門豐度升高[35]。Cattaneo 等則發(fā)現(xiàn)，腸道促炎性大腸埃希菌/志賀氏菌豐度增加，抗炎分類菌群豐度明顯減少[36]。值得注意的是，幽門螺桿菌可通過誘導產(chǎn)生抗炎癥因子IL-10加重AD 的病理過程[37]。1項針對美國成人的回顧性隊列研究也證實男性幽門螺桿菌血清陽性與AD 死亡率呈正相關[38]。有效的藥物治療應糾正腸道菌群的這種異常。我們的研究發(fā)現(xiàn)CP25 給藥對這些菌群有糾正性調節(jié)，Mt模型小鼠中脫乳桿菌屬和不可培養(yǎng)擬桿菌屬等擬桿菌門明顯下降。而在誘導模型中，由于AD 小鼠和正常小鼠的腸道菌群無明顯組間差異，CP25給藥造成的腸道菌群上調或下調則主要由藥物成分決定。比如CP25 可明顯上調梭菌ASF356、毛 螺 菌 屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、脫鐵桿菌屬Mucispirillum、毛螺旋菌屬Parasutterella、普雷沃菌屬Prevotella_1、普雷沃菌屬Prevotella_9、普雷沃氏菌科PrevotellaceaeGa6A1_group 等菌群，我們認為CP25 藥物成分中有類似益生元的組分。值得一提的是，在兩種模型中，CP25 均顯著上調Mucispirillum，但該菌屬在AD 模型屬中的豐度并無明顯差異。CP25 對Mucispirillum的調節(jié)作用是否有利于AD 改善尚需要進一步研究。有研究表明Mucispirillum schaedleri幫助宿主抵御鼠傷寒沙門氏菌（S.Tm）引 發(fā) 的 腸 道 炎 癥[39]。 同 時 本 文 發(fā) 現(xiàn)uncultured_Bacterodales_bacterium在AD 小鼠中的豐度明 顯 高 于 正 常 小 鼠 ，ruminococcus-1 和Ruminiclostridium-9 的豐度低于正常小鼠，這些結果與Zhang等對AD小鼠腸道菌群的研究一致[40]，CP25治療可糾正這種由AD 疾病導致的腸道菌群的異常升高。這些結果提示腸道菌群Muribaculum的調節(jié)是CP25治療AD的途徑之一。目前的研究認為腸道菌群通過腦腸軸、分內泌、代謝和免疫等多種途徑影響AD的發(fā)生和發(fā)展[34]。CP25 對AD 小鼠腸道菌群的調節(jié)可能通過復雜的機制網(wǎng)絡來改善AD 的認知功能和病理表現(xiàn)，比如抑菌、消炎、提高免疫等，這些都有賴于進一步的深入研究。

綜上所述，通過對兩種AD 模型小鼠的比較研究，我們發(fā)現(xiàn)CP25 口服給藥可正向調節(jié)腸道菌群，提示腸道菌群可能是CP25 的潛在作用靶點。本文結論將對CP25 用于阿爾茲海默癥這種多病因的疾病的治療提供理論依據(jù)和機理支持，為阿爾茲海默癥的治療提供另外一種干預手段。