中藥調節內質網應激治療神經退行性疾病研究進展＊

符小梅，宋 雷，方淑環，方堅松

（廣州中醫藥大學科技創新中心 廣州 510405）

神經退行性疾病是以神經元變性為基礎，蛋白質堆積為特征的年齡相關性疾病。隨著人類壽命的延長，人口逐步老齡化，神經退行性疾病的患病率也在不斷上升，給家庭及社會帶來巨大壓力。以患病率最高的神經退行性疾病-阿爾茲海默癥（Alzheimer disease，AD）為例：至2020 年，在美國僅65 歲及以上AD 患者達620 余萬人，其治療、護理花費總金額約達3050 億美元。盡管形勢嚴峻，但是抗AD 藥物的研發狀況并不樂觀。據美國藥品研究與制造商協會報告，僅1998 至2017 年期間，就有高達146 個抗AD 藥物臨床試驗以失敗告終，僅5 種藥物上市，2020 年，中藥單體甘露特納被批準上市，但均不能有效阻止或延緩AD 的病情發展。帕金森病（Parkinson’s disease，PD）在中國患病率達1700/10 萬，是第二種常見神經退行性疾病，目前PD 的綜合治療僅能改善癥狀、延緩病情進展，藥物治療作為其主要的治療手段，仍缺乏有效治療藥物，而其余類型神經退行性疾病的藥物治療情況亦是如此[1-2]。

神經退行性疾病的發病機制復雜，研究者們針對病理機制和結果開展了多項研究，但均未見較滿意的結果。因其病理特征與ERS 有許多共同之處，均可見錯誤折疊蛋白質堆積，其過程均與氧化應激、神經炎癥、線粒體功能障礙、鈣離子紊亂、自噬等相關[3-5]。這給神經退行性疾病的治療提供了新思路。近期發現選擇性抑制ERS 關鍵靶點具有明顯神經保護作用。其中，蛋白激酶RNA 樣內質網激酶（PERK，PKR-like ER kinase）抑制劑，二苯甲基甲烷和鹽酸曲唑酮，在體外和體內逆轉了磷酸化真核翻譯起始因子（phosphorylated eukaryotic initiation factor 2α, p-EIF2α）介導的翻譯衰減，兩種藥物在小鼠神經變性模型中均具有明顯的神經保護作用[6-10]，這意味著通過抑制內質網應激，治療神經退行性疾病或存在可能。

中藥于疾病具有巨大的潛力，大量的臨床前研究或報道發現中藥或單體可通過調節內質網應激保護神經元，在神經退行性疾病具有一定的潛在療效。基于中藥活性成分復雜、作用靶點多、影響多個環節、多條途徑的特點[11]，本文綜述了現有的中藥或單體調控內質網應激防治神經退行性疾病的相關進展，總結了其調控的具體分子機制，為中藥調控內質網應激抗神經退行性疾病的新藥研發提供有力證據，以期為后續的實驗研究提供線索及依據。

1 內質網應激

內質網是真核細胞中的一個由膜系統組成的細胞器，為核糖體翻譯后的蛋白質合成、轉運、折疊以及鈣儲存的主要場所。在各種因素如氧化應激、蛋白毒性物質、鈣離子紊亂、炎癥、線粒體功能障礙、自噬缺陷等影響下，未折疊和（或）錯誤折疊蛋白質蓄積，內質網穩態改變，內質網通過促進蛋白質正確折疊的適應性反應，即內質網應激。未折疊蛋白反應（unfolded protein response,UPR）是細胞ERS 過程的一種常見適應性反應方式。

UPR 由三種傳感器蛋白控制：①PERK，這是一種I 型內質網跨膜蛋白；②肌醇需要跨膜激酶（inositolrequiring protein 1,IRE1），同樣屬于I 型內質網跨膜蛋白，其活化后具有核糖核酸內切酶活性；③跨膜介質激活轉錄因子6（activating transcription factor 6,ATF6）[14-17]。

生理狀態下，PERK、IRE1、ATF6 三種感受器蛋白質與免疫球蛋白結合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP）,又稱78KDa 葡萄糖調節蛋白（glucose regulated protein78kD, GRP78）結合，當錯誤折疊的蛋白質增多時，結合狀態解離，為促進蛋白質的正確折疊，GRP78 轉而結合未折疊蛋白質，但當GRP78 達到極限不能徹底清除堆積的蛋白從而使得細胞損傷不可逆時，解離后的三種蛋白激活并作為轉錄因子啟動UPR 信號級聯反應。反應初期，PERK 二聚化后自磷酸化，使真核翻譯起始因子（eukaryotic initiation factor 2α, EIF2α）磷酸化，p-EIF2α 可減少錯誤蛋白的翻譯，從而達到保護細胞的作用；長期持續或嚴重應激，p-EIF2α 可選擇性激活激活轉錄因子4（activating transcription factor 4, ATF4）mRNA，該mRNA編碼一種轉錄因子，可誘導參與抗氧化反應、氨基酸代謝和凋亡的基因的表達。同初期IRE1 二聚化后自磷酸化，其具有核糖核酸內切酶活性，可剪切轉錄因子X 盒結合蛋白（X-box binding protein1,XBP1），XBP1 可調節蛋白質的表達；磷酸化的IRE1 還可結合腫瘤壞死因子相關因子受體2（tumor necrosis factorassociated factor 2,TRAF2）形成IRE1-TRAF2 復合物，激活和征募凋亡信號調節激酶1（Apoptosis signalregulating kinase 1,ASK1），ASK1可激活氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK），XBP1、JNK 均可促細胞自噬及凋亡。ATF6的激活，于高爾基體位點1蛋白酶（site-1protease, S1P）和 位 點2 蛋 白 酶（site-2protease,S2P）處理后，進入細胞核，ATF6可介導同源蛋白質（C/Ebp-Homologous Protein，CHOP）、XBP1 和GRP78 上調，CHOP 為一種促凋亡信號。三條信號傳導通路均可觸發促凋亡信號CHOP與胱氨酸特異蛋白酶12（Caspase-12）的表達，最終導致細胞的凋亡[12-18]。總之，反應早期，ERS 可促進錯誤蛋白的折疊，減少錯誤蛋白的翻譯，調節蛋白的表達，保護細胞，促進細胞存活，但持續或嚴重的ERS，細胞穩態失衡，將導致細胞的凋亡，加快疾病的發展過程。

有趣的是，研究發現IRE1蛋白水平均在響應內質網應激時短暫升高，并且在ATF6 缺乏表達的細胞中進一步升高，而ATF6 轉錄活性N 端結構域的過表達逆轉了IRE1水平的升高，同時發現，PERK-ATF4信號增強了ATF6 的表達，并增強了其向高爾基復合體的運輸，表明各通路之間是相互影響而非獨立的[17,19]。

2 內質網應激與神經細胞凋亡

2.1 病理

神經退行性疾病如AD、PD、肌肉萎縮性側面硬化病（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等是以原發性神經元變性為基礎的慢性進行性神經系統疾病，其病理過程均可見細胞內外錯誤折疊和未折疊的蛋白質積累，某些情況下，這些蛋白聚集物可能引發內質網應激條件。同時，神經退行性疾病許多病理特征可能與ERS 有關，這些病理也可觸發ERS，并可被UPR 調節[12,20]。其過程可能如下，如AD 患者，細胞外的β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）堆積，一方面使細胞外鈣離子內流，細胞質鈣離子升高，線粒體與內質網鈣離子失衡；另一方面線粒體調節能量代謝障礙，活性氧增多，加之，細胞內Aβ 淀粉樣蛋白與高度磷酸化的tau 蛋白堆積，均可誘發內質網的自代償反應。然而長期持續的刺激，UPR 無法恢復細胞正常狀態，與GRP78 解離后的3 種感受器蛋白分別激活，PERK、IRE1α蛋白二聚化后自磷酸化，觸發級聯反應，并調節抗氧化反應、氨基酸代謝等，早期減少錯誤蛋白蓄積，長期應激則促凋亡信號增多，促神經元凋亡；ATF6 于高爾基體S1P、S2P 位點剪切后進入細胞核，其過程亦可影響PERK、IRE1α通路，促細胞凋亡[17,21-22]。

2.2 標志物

實際上，研究人員早已發現ERS 在神經退行性疾病病理中扮演至關重要的角色，如AD、PD、ALS 等患者和動物模型的腦組織均可檢測到ERS 標志物，包括PERK、GRP78、IRE1、CHOP、Caspase-12、ATF6 等的升高，體外實驗也可見ERS相關蛋白質的升高[23]。

研究表明，PERK、IRE1和ATF6在AD、PD、ALS等患者、動物和細胞系中的作用不盡相同，但總的來說，減輕內質網應激水平和恢復內質網蛋白平衡的策略能夠對神經退行性疾病產生有益的結果。同時，相對于促細胞凋亡，PERK 通路在細胞保護方面似乎更重要，神經細胞內的錯誤折疊和未折疊蛋白質積累，隨后通過依賴于PERK的方式激活UPR信號通路。在輕度至中度內質網應激下，UPR 具有促進適應的作用。然而，嚴重或長期的內質網應激直接引起UPR 向其促凋亡分支轉移，這被認為是神經退行性變的一個可能原因。因此，在分子水平上抑制PERK 介導的促凋亡UPR 信號分支可能有助于開發一種新的靶向治療神經退行性變的策略，抑制PERK 通路的藥物也在進一步研究中[24]。

3 中藥調節神經內質網應激

3.1 中藥的神經保護作用

中藥及復方具有臨床用藥經驗豐富、作用溫和、毒副作用較小等特點。至今已有許多關于中藥神經保護的相關報道，其神經保護的機制主要與抗炎、氧化應激，調節能量代謝以及內質網應激等相關。謝寧、姜卓等發現地黃飲子對海馬神經元具有一定的保護作用，可對抗Aβ25-35誘導的海馬神經元自由基損傷[25]。曾克武等發現加味五子衍宗丸可能通過多途徑，包括抗炎、抑制氧化應激、調節線粒體功能等，改善神經病理損傷發揮抗癡呆和神經保護作用[35]。芍藥甘草湯可通過發揮抗氧化和抗炎活性來抑制人源tau細胞模型中的神經元凋亡，從而起到保護神經的作用。二至丸可調節腹膜D-半乳糖注射與胸腺切除術聯合誘導的大鼠衰老過程中的線粒體功能，抗氧化，調節Ca2+提高ATP酶的活性，抑制內質網應激，減輕大腦皮層神經元凋亡[26,27,53]。枸杞多糖可通過調節海馬-內質網氧化應激、神經炎癥，從而保護慢性間歇性缺氧SD 大鼠的神經元，減少神經元凋亡[28]。黃芩素可預防魚藤酮引起的行為缺陷、多巴胺能神經元丟失、細胞凋亡和線粒體功能障礙，達到神經保護作用[29]。總之，中藥可從多角度發揮神經保護作用。

3.2 中藥抑制神經元內質網應激

章時杰等用中藥單體巴戟甲素作用于APP/ PS1雙轉基因小鼠，結果顯示，巴戟甲素可保護神經元，減少凋亡，提高神經營養因子表達水平，機制可能與通過減輕海馬和皮質ERS有關[30]。研究表明白藜蘆醇可抑制HT22 細胞ERS，減少神經細胞凋亡[31-32]。小檗堿可增加轉基因小鼠海馬神經元GRP78及Bcl-2的蛋白表達,減少促凋亡基因表達，提高細胞存活率，表明其體外可抑制神經元ERS,減少神經細胞的凋亡[33]。歐欣霞等實驗發現蟲草素灌胃用于四氫吡啶誘導的PD小鼠模型上，GRP78、CHOP 表達水平下調，提示蟲草素可能通過其抑制ERS 和神經炎癥反應保護PD 小鼠黑質多巴胺能神經元；蟲草素還可減少Aβ31-42寡聚體誘導AD 模型大鼠神經元的損傷[34]。藏紅花素具抗氧化應激和抗炎因子的功效，體內外研究均提示其神經保護作用與抑制ERS相關[35]。五味子甲素可同時抑制內質網應激和減少神經炎癥，保護神經元，改善鏈脲佐菌素（streptozocin，stz）誘導的認知功能障礙[36]。西洋參皂苷在體內外實驗中均可抑制ERS 介導的細胞凋亡和神經突觸損傷[37]。蓯蓉舒精顆粒通過誘導GRP78 的表達，減少神經細胞凋亡[38]。益智防呆方可影響Aβ 誘導的SH-SY5Y 細胞ERS 相關蛋白GRP78蛋白的表達，達到治療AD的效果[56]。

3.3 中藥調節PERK 信號傳導通路及其他信號傳導通路

章時杰等人用補腎益智方治療SAMP8 快速衰老小鼠，發現ERS 相關蛋白Caspase-3、PERK、IRE1α、EIF-2α、BIP、CHOP、Bcl-2、Bax 均下調，提示補腎益智方的神經保護機制可能內質網應激通路有關，尤其是PERK 和IRE1α 通路[49-50]。研究者使用β-細辛酮干預6-OHDA 誘導的PD 小鼠，發現GRP78、P-PERK、PIRE1、IRE1、XBPI、CHOP 均下調，Bcl-2 上調，提示β-細辛酮可能通過抑制PERK 和IRE1α 通路，起神經保護作用[39-40]。石斛堿可能通過抑制內質網應激相關的PERK 信號通路，依次抑制calpain1（鈣蛋白酶）、GSK-3β（糖原合成酶激酶-3）和Cdk5（細胞周期素依賴蛋白激酶5，Cyclin-dependent Kinase 5），活性，最終降低Tau 蛋白的超磷酸化，從而改善老年SAMP8 小鼠的認知功能缺陷[41]。松果菊苷可抑制雙轉基因PD 小鼠ERS 相 關 蛋 白GRP78、P-PERK、P-EIF2α，促 進PERK-FLNA 結合，調節f-肌動蛋白重構，顯著降低腦Aβ 的產生和積累[42]。李彪等研究發現白藜蘆醇可能是通過參與PERK 信號通路介導的細胞凋亡抑制ERS，減少AD大鼠神經元Aβ淀粉樣蛋白的沉積，抑制細胞的凋亡[31,32]。紅景天苷可使6-OHDA 誘導的PD小鼠ERS 相關蛋白BiP、p-PERK p-IRE1 下調，減輕細胞毒性，減少神經元凋亡[43]。楮實提取物可抑制β25-35聯合D-半乳糖誘導大鼠復合損傷AD 模型PERK 通路，改善AD大鼠記憶學習能力[51]。人參及人參皂苷可通過抑制PEFK/ATF4/CHOP 通路，保護神經元，免受谷氨酸誘導的ERS的影響[52,54]。

在腹腔注射魚藤酮向日葵油乳所致的PD 大鼠模型中，蓯蓉舒精顆粒可下調GRP78、JNK、IRE1、p-IRE1α、p-JNK、Caspase-12，提示蓯蓉舒精顆粒可能通過減弱IRE1α 通路，抑制神經元凋亡[44]。毛蕊花苷可抑制Aβ 誘導的U251 細胞、APP/PS1 雙轉基因小鼠ERS三條通路相關蛋白的表達，保護神經元[55]。綜上，在體內外實驗中，中藥復方或中藥單體均可通過調節內質網應激保護神經元，具體如表1所示。有趣的是，研究發現，中藥對內質網應激的調節，可能與調節鈣離子，能量代謝，氧化應激，也可與PERK 通路，IRE1通路，甚至多條通路相關如圖1所示。

圖1 中藥復方或中藥單體抑制內質網應激改善阿爾茨海默癥

表1 中藥復方及中藥單體調節內質網應激減少神經細胞凋亡表

續表

4 總結與展望

神經退行性疾病的發生發展進程動態變化，涉及多個方面，治療困難，雖然現有研究表明中藥可能通過抑制ERS 減少神經細胞凋亡，從而達到治療神經退行性疾病的效果，但其具體機制仍未完全明確。比如很多研究僅表明中藥可以影響ERS 的相關蛋白，但是其直接作用或主要作用靶點未知，其影響ERS 可能是上游誘因如抑制氧化應激、線粒體，也可能是直接作用于錯誤折疊的蛋白質，或者是抑制PERK 等蛋白的磷酸化而形成的負反饋，或者同時抑制多靶點、多通路，總之具體作用靶點仍是未明。

其次，中藥作用成分復雜，單味中藥包含幾十或上百的天然產物單體，而中藥復方更是復雜。相關研究僅表明單味藥材或復方影響ERS，但其真正起效的單體成分未明，同時中藥或復方其有效成分之間可能存在協同或拮抗作用，或相互影響體內吸收或代謝，其具體的作用機制仍待進一步研究。中醫藥具有豐富的臨床用藥經驗，部分中藥在臨床上具有確切的抗神經退行性疾病療效，基礎研究也說明了其具神經保護作用。然通過抑制ERS 保護神經元的研究仍是處于臨床前期早期階段，需要更多的臨床與實驗數據。

綜上，神經退行性疾病與ERS 密切相關，中藥可通過調節ERS 減少神經細胞凋亡，但其作用機制尚不明確，可能與多環節，多通路相關，尤其是PERK 信號傳導通路，具體作用機制需更深一步的研究。