麋角丸改善Aβ1-42海馬區注射小鼠學習與記憶能力的作用機制研究＊

孟雪兒，樓倩穎，曹 程，王青青，佘雨巖，白加德，丁玉華，段金廒，朱 悅＊＊，趙 明＊＊

（1.南京中醫藥大學藥學院/江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心 南京 210029；2.北京麋鹿生態實驗中心 北京 100076；3.江蘇大豐麋鹿國家級自然保護區 大豐 224136）

阿爾茨海默癥（Alzheimer 's disease, AD）是老齡化社會備受關注的神經退行性疾病，以認知功能的進行性下降和神經元的不可逆損失為重要特征[1]。隨著全球老齡化人口急劇增加，中國的人口老齡化率和老年人口數量居世界第一。根據《2018 年世界老年癡呆癥報告》顯示，全球約有5000萬人患有癡呆癥，預計到2050 年，這一數字將增加兩倍，達到1.52 億人，而阿爾茨海默病(AD)占所有癡呆癥病例的50-75%[2]。中國AD 的患病率較高，然而就診率、診斷率和治療率普遍較低，預計未來30年中國的AD患者數量將顯著增加，給社會造成嚴重的經濟負擔。

AD 患者大腦最主要的病理學特征是β 淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成老年斑和tau蛋白異常磷酸化為主要成分的神經纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）[3]。目前認為AD 的病理機制與氧化應激、炎癥反應導致的神經元凋亡高度相關。氧化應激反應中的自由基可促進產生Aβ 聚集，小膠質細胞過度激活和大量釋放的促炎細胞因子均會產生顯著的神經元毒性，誘導神經元凋亡[4]。臨床上治療AD 的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑，但此類藥物會導致胃腸道反應等副作用，前者還禁用于心功能不全患者，從使其臨床應用受到了一定的限制。

到目前為止，全球還沒有藥物可以有效的延緩AD的進展，而中醫藥對AD的防治有著豐富經驗。AD在中醫上屬于“好忘”“癡呆”“呆病”等范疇，并認為髓海空虛，髓減腦消為癡呆的根本病機[5]。中藥復方麋角丸出自唐代孫思邈《備急千金要方》[6]，由麋鹿角、秦艽、人參、甘草、肉蓯蓉、檳榔、通草、菟絲子組成，是補腎名方，原書描述其具有“補心神、安臟腑、填骨髓”之功效。根據中醫學“腎通髓海”的傳統理論及其麋鹿角“補心神”的傳統功效，本研究建立海馬區注射Aβ1-42擬阿爾茨海默癥小鼠模型，評價中藥復方麋角丸對模型動物學習與記憶能力的影響及其神經保護作用機制，為其臨床應用與二次開發提供更多的現代科學依據，并為AD 的防治提供更多的可能性。本研究的詳細流程圖如圖1。

圖1 研究流程圖

1 材料

1.1 實驗動物

健康SPF 級ICR 小鼠，雄性，體質量20-23 g，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場，動物申請許可證號為：SCXK（滬）2018-0004。動物飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心SPF 環境中，常規飼養，溫度22-25℃，濕度40%-70%。本實驗獲得NJUCM 動物實驗倫理委員會的批準。

1.2 實驗藥物

麋鹿角Elaphurus davidianusMillne-Edwards 采集于江蘇大豐濕地公園6 歲齡麋鹿，秦艽（Gentiana macrophyllaPall.，批號：201205）、人參（Panax ginsengC.A.Mey.，批號：190615）、甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.，批號：200128）、肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma.，批號：190808）、檳榔（Areca catechuL.，批號：210118）、木通（Akebia tri foliata（Thunb.）Koidz.，批號：201116）、酒菟絲子（Cuscuta chinensisLam.，批號：202022）采購于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經南京中醫藥大學鑒定教研室劉圣金教授鑒定為合格藥材。

1.3 實驗試劑

Aβ1-42（20JW09891）合成多肽購自上海諾優生物科技有限公司；石杉堿甲（H107336）購自北京伊諾凱科技有限公司；雙色預染蛋白Marker 購自南京麥高德生物科技有限公司；10、12.5%凝膠試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；RIPA 裂解液購自碧云天公司；BCA 試劑盒（P0009）購自南京何苗生物技術有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（JEB-12474-1）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（JEB-12787-1）、小鼠白介素6（IL-6）ELISA 試劑盒（JEB-12267-1）均購自南京金益柏生物技術有限公司；小鼠超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（A001-3-2）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（A020-202）、丙二醛（MDA）試劑盒（A003-4-1）均購自南京建成生物公司研究所；通用型抗體稀釋液，購自南京迅貝生物科技有限公司；ECL化學發光液，購自上海天能科技有限公司；Nrf2 Rabbit mAb（12721T）、Caspase-9 Mouse mAb（9508S），均購自CST 公司；HO-1 Rabbit antibody（10701-1-lg）、Caspase-3 Rabbit antibody（66470-2-lg）、β -actin Mouse antibody（66009-1-lg）均購自proteintech 公司；Bax（F2816）、Bcl-2（G2915）抗 體，購 自Santa Cruz Biotechnology 公司；二抗HRP-Linked Anti-Mouse IgG（BA1050），HRP-Linked Anti-Rabbit IgG（BA1054），購自BOSTER公司。

1.4 實驗儀器

高速冷凍離心機（美國BECKMAN 公司）；旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI 公司）；動物行為測試系統（上海吉量軟件公司）；全自動樣品快速研磨儀（上海凈業信發展有限公司）；多功能酶標儀（美國PE Enspire 公司）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；AXIOVert.A1熒光倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）。

2 方法

2.1 麋角丸提取物的制備

取麋鹿角切割，搗碎，打粉，稱取34 g 麋鹿角粉，加8 倍水提取8 h，回流提取三次，過濾，合并濾液。稱取秦艽、人參、肉蓯蓉、檳榔、木通、酒菟絲子各31.25 g，提取時間2 h，加8 倍80%醇回流提取2 h，提取兩次，收集濾液，與麋鹿角水提液合并濾液，減壓濃縮至麋角丸提取物濃縮液濃度為1 g·mL-1（按生藥量折算）。

2.2 AD動物模型建立及給藥

健康ICR 小鼠90 只，適應性飼養一周后隨機分為6組，每組15只。分為空白組、假手術組、模型組、陽性藥組、麋角丸低劑量組、麋角丸高劑量組。取小鼠稱重，1%戊巴比妥鈉腹腔注射小鼠（40 mg·kg-1），麻醉后剃除頭頂局部毛發，進行海馬區注射Aβ1-42擬AD 小鼠模型手術，手術的具體方法參考文獻[7]。小鼠術后常規飼養，傷口基本愈合后進行灌胃給藥，動物的分組和給藥情況見表1。除上述分組給藥外，另取健康ICR小鼠30 只，隨機分為3 組，分別為空白組、麋角丸低劑量組、麋角丸高劑量組，適應環境后灌胃麋角丸低、高劑量10天后進行正常小鼠自發活動的評估。

表1 動物分組和給藥劑量

2.3 行為學測試

2.3.1 Morris水迷宮實驗

小鼠灌胃10 天后進行Morris 水迷宮實驗（Morris water maze，MWM），評價小鼠空間學習和記憶能力。水迷宮具體方法參照課題組已發表的研究文章進行[8]。

2.3.2 曠場實驗

小鼠灌胃10 天后進行曠場實驗（open field test，OPT），評價麋角丸對正常小鼠自主活動的影響。曠場實驗的敞箱裝置為長寬40 cm，高25 cm 的塑料箱，箱的四周底部均為黑色。正式實驗開始時將小鼠由邊緣放入敞箱內，通過動物行為測試系統記錄小鼠在曠場5 min 內的運動總路程和探索曠場中心停留的時間。每只小鼠測試完之后用75%乙醇擦拭敞箱，防止遺留的氣味對下一只小鼠的影響，整個實驗過程保持外部環境安靜[9]。

2.4 海馬區腦片尼氏體染色

小鼠行為學測試后解剖，斷頭，取出大腦，置于4%的多聚甲醛中固定。梯度乙醇脫水，二甲苯脫蠟，將固定的腦組織常規處理石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），尼氏染色，光學顯微鏡下觀察小鼠海馬齒狀回區神經元損傷情況，200倍鏡下拍照。

2.5 炎癥因子含量測定

行為學測試結束后，處死小鼠，解剖獲得海馬組織。稱取相應質量的組織，加入10 倍量的PBS，低溫研磨，離心20 min（2000 轉/分），取上清液待測。按照ELISA 試劑盒所列步驟，測定小鼠海馬中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

2.6 氧化應激因子SOD、LDH、MDA測定

行為學測試結束后，處死小鼠，解剖獲得海馬組織。稱取相應質量的組織，加入10 倍量的PBS，低溫研磨，制成10%的組織勻漿。離心10 min（3000 轉/分），取上清待測，按南京生物建成試劑盒說明書測定SOD和LDH的活力以及MDA的含量。

2.7 Nrf2、HO-1及凋亡蛋白表達測定

每組稱取海馬組織，記錄重量，加入10 倍量的RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑cocktail（50:1），研磨后置于冰上裂解30 min，離心10 min 取上清。按照BCA試劑盒的操作步驟測定總蛋白含量，98℃加熱15 min，使蛋白變性。用上海雅酶公司的10%和12.5%的蛋白凝膠試劑盒制備凝膠，120V 電泳2 h，Nrf2 轉膜時間為2 h，Caspase-9、β-Actin 轉膜時間為1h，Caspase-3、HO-1、Bax、Bcl-2 轉膜時間為50 min，5%脫脂牛奶封閉2 h。結束后加入一抗（Nrf2 Rabbit mAb、HO-1 Rabbit antibody、Caspase-3 Rabbit antibody、Caspase-9 Mouse mAb、Bax antibody、Bcl-2 antibody，抗體比例均為1:2000；β-Actin Mouse antibody，抗體比 例為1:10000），4℃搖床過夜，二抗孵育（Anti-Mouse IgG，Anti-Rabbit IgG，HRP-linked Antibody，抗體比 例1:10000），室溫孵育1h，洗膜后使用凝膠成像系統顯色曝光。

2.8 數據統計與處理

采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行統計分析，數據均使用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），單因素方差分析處理前數據經過正態分布檢驗。數據以P＜0.05 為有差異，P＜0.01有極顯著差異。

3 結果

3.1 麋角丸對小鼠行為學的影響

3.1.1 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠學習與記憶行為的影響

Aβ1-42海馬區注射小鼠給藥10 天后，進行Morris水迷宮行為學測試。結果顯示，與空白組小鼠比較，模型組小鼠潛伏期和上臺前路程顯著增加（P＜0.01），穿越平臺次數顯著減少（P＜0.01）。與模型組相比，麋角丸組小鼠潛伏期和上臺前路程明顯縮短，穿越平臺次數顯著增多（P＜0.05）（圖2）。上述實驗結果表明，麋角丸可明顯改善Aβ 誘導小鼠受損的學習和記憶能力，高劑量組作用趨勢優于低劑量組。

圖2 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠水迷宮行為學的影響（n=11）

3.1.2 麋角丸對正常小鼠自發活動影響

正常小鼠給藥10天后，進行曠場實驗測試。結果顯示，與空白組小鼠比較，麋角丸高低劑量組小鼠在5 min 內的總運動距離和曠場中心停留時間無顯著性差異（圖3）。結果表明，麋角丸對正常小鼠的自發活動無明顯影響。

圖3 麋角丸對正常小鼠自發活動影響（n=10）

3.2 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬DG 區腦片尼氏體染色的影響

對小鼠海馬區腦片尼氏體染色發現，空白組海馬DG 區細胞內尼氏體豐富，排列整齊緊密；而模型組小鼠海馬齒狀回區尼氏體減少，排列紊亂，細胞空泡化明顯（P＜0.01）；與模型組相比，給藥麋角丸組中，尼氏體數量增多，排列趨于整齊，細胞空泡化不明顯（P＜0.05，P＜0.01）（圖4）。實驗結果表明，麋角丸對模型小鼠海馬DG區神經元損傷具有保護作用。

圖4 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬區腦片DG區尼氏體染色的影響（×200）（n=3）

3.3 麋角丸提取物對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織炎癥因子表達水平的影響

ELISA 檢測小鼠海馬組織炎癥因子表達水平結果顯示，模型組小鼠海馬中的TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量較空白組相比明顯上調（P＜0.01），給予麋角丸提取物后，能明顯下調模型組小鼠海馬中炎癥因子的表達水平（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。麋角丸高劑量顯示出較強的作用趨勢。

圖5 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織炎癥因子表達水平的影響（n=8）

3.4 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織氧化應激因子的影響

小鼠海馬組織氧化應激因子表達檢測結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠海馬組織中SOD 活性顯著降低（P＜0.01），LDH 活性和MDA 含量顯著提高（P＜0.01）。與模型組相比，麋角丸高、低劑量組均可提高小鼠海馬中SOD 的含量（P＜0.01），降低小鼠海馬組織中LDH 活性和MDA 的含量（P＜0.01）（圖6）。因此，麋角丸提取物可減輕模型小鼠神經元的氧化損傷。

圖6 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織氧化應激因子表達的影響（n=5）

3.5 麋角丸對Aβ1-42 海馬區注射小鼠海馬區Nrf2、HO-1蛋白表達水平的影響

Western Blotting 評價小鼠海馬區Nrf2 與HO-1 蛋白表達水平結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠海馬組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05，P＜0.01），經過高低劑量的麋角丸作用后，小鼠海馬中的Nrf2和HO-1蛋白表達水平升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01）（圖7）。提示麋角丸提取物可能通過Nrf2/HO-1 通路發揮抗氧化作用保護神經元細胞免受損傷。

圖7 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平的影響（n=5）

3.6 麋角丸對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織凋亡通路蛋白表達水平的影響

Western Blotting 法測試小鼠海馬組織凋亡通路蛋白表達發現，與空白組比較，模型組小鼠海馬Bcl-2/Bax 蛋白表達水平顯著降低，Caspase-3、Caspase-9 表達水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。高、低劑量麋角丸不僅可以逆轉小鼠海馬中Bcl-2/Bax 蛋白的表達水平，而且可以顯著降低模型組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平（P＜0.05，P＜0.01）（圖8）。這些結果表明，麋角丸提取物可減少模型小鼠海馬區細胞凋亡。

圖8 麋角丸對Aβ 海馬區注射小鼠海馬組織凋亡通路蛋白表達水平的影響（n=4）

4 討論

AD的病理特征包括Aβ過度積累、tau蛋白過度磷酸化及氧化應激與中樞炎癥等[10]。一般認為，Aβ 沉積和清除不平衡是引起AD 的源頭，進而誘發記憶喪失和認知受損。Aβ 過度沉積會加快AD 患者體內神經炎癥和氧化應激反應，從而導致神經元凋亡[11]。因此Aβ是AD發生與發展中的關鍵致病因素。

研究表明，AD 患者大腦都存在著海馬神經元受損現象[12]，海馬可被分為海馬角（cornuammonis，CA）和齒狀回（dentate gyrus，DG），這些區域都與學習記憶和空間認知功能相關。DG 區是海馬信息的傳入點，并且作為神經發生的關鍵區域，可終生形成新神經元，在空間信息編碼以及學習記憶中起著重要作用[13]。Okada等人發現CA3病變并不影響實驗鼠水迷宮實驗的表現，而DG 區病變導致的水迷宮空間學習記憶障礙最為嚴重[14]。這與Kesner 等人發現DG 損傷導致的缺陷與完全海馬損傷相似[15]。同時羅財妹等人發現AD 患者DG 區體積隨著疾病的進程顯著下降，猜測海馬齒狀回可能是AD 發病的重要位點[16]。尼氏體可反應神經元的功能情況，在正常狀態下有固定的形態，而當神經元受損時，尼氏體會變得模糊或消失，因此可通過尼氏體的變化反映神經元的功能狀態[17]。因此在本研究中選用了DG 區作為觀察Aβ1-42海馬區注射小鼠腦片尼氏體染色的影響，結果發現麋角丸作用后可增加DG 區尼氏體的數量，表明麋角丸對模型小鼠海馬DG 區神經元損傷具有一定的保護作用。同時本研究考察了麋角丸對正常小鼠自發活動的影響，結果發現給藥后與空白組小鼠相比總運動距離和曠場中心停留時間無明顯差異，因此麋角丸改善Aβ 誘導小鼠受損的學習和記憶能力并非麋角丸引起的神經興奮作用。

臨床發現，AD 患者血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯升高。Aβ 沉積可激活AD 患者腦部小膠質細胞釋放大量促炎細胞因子，如白細胞介素（IL-1β、IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α），從而引發炎癥與免疫反應產生神經毒性[18]。同時Aβ 引起的炎性因子會加劇氧化應激反應，惡化AD 患者大腦神經元的氧化損傷[19]。氧化應激發生時腦組織中核轉錄因子NF-E2 相關因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶-1（HO-1）通路被激活，細胞內Nrf2 可產生明顯的抗氧化作用，減少神經細胞的凋亡[20]。HO-1 是Nrf2 調控的最重要的抗氧化保護蛋白，Nrf2/HO-1 通路的激活可抑制氧化應激及淀粉樣蛋白沉積，并導致學習和記憶功能的改善[21]。Aβ 誘發的氧化應激會在腦中產生過量活性氧（ROS），從而抑制抗凋亡因子2 型B 淋巴細胞（Bcl-2），并刺激促凋亡因子如Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）以及凋亡相關蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表達，誘導神經元凋亡[22]。因此，降低AD患者體內Aβ含量、減少患者體內的炎癥反應以及氧化應激可能是治療AD 的有效手段。

中醫雖無AD 病名的記載，但其核心癥狀記憶障礙與認知損傷，可歸為“好忘”“呆病”“癡證”等證[23]，中醫認為AD 的病機在腦，但與腎的臟腑機能高度相關。中醫理論主“腎藏志”，“志”是對神志活動的高概括，也是精神活動的集中體現。“腎藏精”，腎精是人生命的本原物質。老年人群年事日高，腎精虧虛，髓海失養，易出現認知障礙等神志活動異常現象[24]。因此補腎填精是中醫用治AD 的重要治則治法。麋角丸出自唐代孫思邈《備急千金要方·卷十九腎臟·補腎第八》，是中醫補腎著名方劑，原書用于治療“五勞六極七傷虛損”。方中麋鹿角、肉蓯蓉、菟絲子溫腎陽，益精血；人參、甘草益氣；秦艽，檳榔，木通祛風通絡利濕。通補結合，補而不滯，功可“補心神、安臟腑、填骨髓”[25]。但是其現代研究未見報道，影響了該方的臨床應用與現代開發。

本研究發現Aβ1-42海馬區注射小鼠存在嚴重的記憶障礙，通過尼氏體染色發現模型小鼠海馬DG 區出現神經元損傷，而麋角丸對其神經元損傷具有一定的保護作用。麋角丸可能通過下調海馬區中樞炎癥因子表達，調控氧化應激因子和Nrf2/HO-1 信號通路緩解海馬組織氧化應激損傷，降低凋亡相關因子Caspase-3 和Caspase-9，提高Bcl-2/Bax 水平從而抑制小鼠海馬神經元凋亡等途徑改善模型小鼠的學習與記憶能力。已有報道顯示，麋鹿角粉具有抗衰老、提高學習記憶等作用[26]。課題組前期研究發現，麋鹿角水提物具有顯著抗抑郁效用，并可以下調抑郁模型動物血清和海馬中壓力因子和促炎物質的表達，上調模型動物腦中神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）的水平[27]。其他藥味的有效成分如人參皂苷、甘草素均可改善阿爾茨海默癥模型動物學習與記憶能力[28,29]。秦艽堿、檳榔堿、以及木通三萜皂苷也有抗炎、抗氧化等作用[30-32]。因此麋角丸改善Aβ1-42海馬區注射小鼠學習與記憶能力的效用應是方中藥味所含成分共同作用的結果。

中國是世界上阿爾茨海默病患者最多的國家，該病的社會成本構成了沉重的經濟負擔。制定切實有效的防治策略，并從傳統藥物中尋找治療AD 的新藥，將減輕AD 對家庭和社會造成的負擔，有助于提高老年人的生活質量，形成一個健康的老齡化社會。本次研究中，首次發現麋角丸具有改善Aβ1-42海馬區注射小鼠學習與記憶能力，在后續研究中，我們將深入探索麋角丸改善學習與記憶能力的作用機制與功效物質基礎，以期為麋角丸的臨床應用與產品開發提供更多的現代科學依據支持。