基于消腫定痛功效的三七粉質量標志物研究＊

韓彥琪，李 新，王德勤，徐 旭，郭海彪，許 浚，4，張鐵軍，4＊＊，李楚源＊＊

（1.天津藥物研究院/天津市中藥質量標志物重點實驗室 天津 300301；2.天津藥物研究院/中藥現代制劑與質量控制技術國家地方聯合工程實驗室 天津 300301；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510515；4.天津藥物研究院/釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室 天津 300301）

三七來源于五加科植物Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥根和根莖，又名田七，是我國傳統名貴中藥材，歷代本草和各版《中華人民共和國藥典》中均收載此中藥，其性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，主要用于咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外傷出血，胸腹刺痛，跌撲腫痛[1]。《本草綱目》中記載：“三七近時始出，南人軍中用為金瘡要藥，云有奇功”，《本草綱目拾遺》中記載：“人參補氣第一，三七補血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥中之最珍貴者”。現代研究發現，三七有效成分為三七總皂苷類成分，如三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re 等，以及三七素、黃酮類成分、揮發油成分等，其具有活血化瘀、止血、抗血栓等多種功效，目前已廣泛應用于心腦血管系統、血液系統、神經系統以及免疫系統等臨床治療中[2-5]。

除治療內傷出血、瘀血外，三七還擅治療跌打、金刃等外傷引起的瘀血腫痛，具有消腫、散瘀、止痛的功效，是中醫傷科藥物中的首選，為治療跌打損傷的常用藥[6]，著名的“云南白藥”，即以之為主藥。有研究者運用角叉菜膠、巴豆油、蛋清等各種致炎劑對小鼠和大鼠分別進行耳廓致炎處理和足部腫脹處理，通過三七干預后，發現其對各種致炎劑均有顯著抗炎功效[7]。另外，三七中的三七總皂苷能有效抑制磷酸組胺、角叉菜膠誘導的大鼠踝關節腫脹，抑制炎細胞增多和蛋白滲出，對急性炎癥引起的毛細血管通透性升高、炎性滲出和組織水腫以及炎癥后期肉芽組織增生也均有抑制作用[8]。其作用機制可能與三七總皂苷阻止炎細胞內游離鈣水平的升高，抑制灌流液中磷脂酶A2的活性，減少地諾前列酮的釋放有關[9]。另有報道，三七總皂苷可以激動阿片肽樣受體，對化學和熱刺激引起的疼痛有一定的鎮痛作用，且沒有成癮性[10]。

雖然目前對三七抗炎鎮痛藥效有較多的報道，但對其藥效物質基礎的研究依舊比較欠缺，對其消腫定痛功效的質量標志物研究更是未見報道。因此本研究首先通過小鼠醋酸扭體實驗評價三七粉及三七總皂苷的鎮痛藥效，進一步采用LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型，探討三七粉中的三七總皂苷及14個代表性單體成分的抗炎作用，初步解析三七粉消腫定痛藥效物質基礎，明確質量標志物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

實驗動物：ICR 雄性小鼠，體質量18-22 g，斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。

RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細胞系購于上海生科院。用含1%雙抗和10%FBS 的DMEM 高糖培養基培養于37℃、5%CO2的培養箱中，1-2天傳代一次。

1.2 實驗藥物及試劑

三七粉由廣州白云山和記黃埔提供，三七總皂苷（PNS）由實驗室自制。14 個標準品人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷F2、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rk1、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、三七素、槲皮素購自上海源葉生物科技有限公司，純度HPLC≥98%。阿司匹腸溶片林購自拜耳醫藥；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自天津市凱信化學工業有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、地塞米松購自美國Sigma 公司；一氧化氮試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 實驗主要儀器

倒置顯微鏡（日本Olympus 公司），酶標儀（德國Berthold公司），細胞培養箱（日本Olympus公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 三七粉及三七總皂苷對小鼠扭體法鎮痛實驗的影響

ICR 小鼠80只，隨機分為8組，對照組，三七粉低、中、高劑量組，三七總皂苷低、中、高劑量組，陽性藥阿司匹林組。對照組給予0.5% CMC-Na 懸液，三七粉低、中、高三個劑量組分別灌胃給予三七粉混懸液1.1 g·kg-1、2.2 g·kg-1、4.4 g·kg-1，三七總皂苷低、中、高劑量組分別灌胃給予三七總皂苷0.25、0.5、1 g·kg-1，相當于1.1、2.2、4.4g生藥·kg-1，陽性藥組給予阿司匹林0.12 g·kg-1，給藥體積20 mL·kg-1，每日給藥1 次，連續給藥3天。第3 天給藥后1 h，小鼠腹腔注射1%醋酸溶液按0.2 mL/只，室溫保持在28°C左右。

注射5 min 后觀察15 min 內小鼠體態變化情況及發生扭體反應的次數，以腹部凹陷、臀部歪扭、身體扭曲、或抽胯為扭體一次的標準。記錄扭體次數，統計分析各組差異。

1.4.2 三七總皂苷及化合物對RAW264.7細胞增值的影響

取對數生長期細胞，調整密度為2×105個/mL，接均勻種于96 孔板，37.5℃、5% CO2培養過夜。按實驗分組，空白對照組（Control）每孔加100 μL 基礎培養基，三七總皂苷給藥組每孔加100 μL 終濃度分別為0.8 μg·mL-1、4 μg·mL-1、20 μg·mL-1、100 μg·mL-1、500 μg·mL-1的溶液，三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、槲皮素、三七素給藥組每孔加入100 μL 終濃度為1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1的溶液，每組設3 個復孔，DMSO 濃度為1‰。給藥后于37.5℃、5%CO2培養箱中培養24 h，棄上清，每孔加入120 μL MTS（每100 μL培養基加20 μL MTS），37℃，5%CO2的環境下孵育1 h后490nm 下讀取吸光值，檢測不同濃度三七總皂苷及單體化合物對細胞增殖的影響。

1.4.3 三七總皂苷及單體化合物對LPS 誘導RAW264.7細胞炎癥反應的影響

取對數生長期細胞，以2×105個/mL均勻接種于96孔板，培養于37 ℃、5% CO2培養箱，過夜。實驗分空白組（control）、模型組、陽性藥地塞米松組（Dex）、三七總皂苷給藥組，空白組每孔加入100 μL 含2%血清的DMEM，模型組每孔加入100 μL 終濃度為0.1 μg·mL-1的LPS，陽性藥組每孔加入終濃度為100 μmol·L-1地塞米松和0.1 μg·mL-1LPS 的混合溶液100 μL，三七總皂苷給藥組每孔加入終濃度為0.2 μg·mL-1、2 μg·mL-1、20 μg·mL-1三七總皂苷及0.1 μg·mL-1LPS 的混合溶液100μL，每組設3個復孔。

人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、槲皮素在100 μmol·L-1給藥濃度下對細胞存活率有一定的影響，而在100 μmol·L-1對細胞無毒性，因此以上5 個單體化合物給藥組每組加入100 μL 終濃度為10 μmol·L-1、1 μmol·L-1、0.1 μmol·L-1樣品和0.1 μg·mL-1的LPS 混合溶液。MTS 預實驗中，三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、三七素在100 μmol·L-1給藥濃度下對細胞無毒性，因此以上9 個化合物給藥濃度設為100 μmol·L-1、10 μmol·L-1、1 μmol·L-1，每組3 復孔，培養24 h 后用ELISA 方法對細胞上清液中的NO、TNF-α、IL-6 含量進行檢測，步驟詳見試劑盒說明書。

1.4.4 統計學處理

所有數據均使用GraphPad Prism 5 軟件進行統計處理，用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance, one-way ANOVA），P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 三七粉及三七總皂苷對小鼠醋酸扭體的影響

2.1.1 小鼠體態變化情況

小鼠腹腔注射1%醋酸溶液后，均出現不同程度的體態變化。對照組小鼠腹痛癥狀最為嚴重。三七粉及三七總皂苷高劑量組小鼠表現為腹部連續抽搐、內凹，行動遲緩、蠕行，向后蹬腿，腹痛癥狀較輕。三七粉及三七總皂苷低劑量組小鼠的表現為抽搐劇烈，急躁不安，有閉眼現象，腹痛癥狀較為嚴重。由此推測，三七粉及三七總皂苷對醋酸引起的腹痛起到了一定的緩解作用。

2.1.2 小鼠扭體次數結果

由表1 可知，陽性藥阿司匹林組小鼠的扭體次數顯著低于對照組（P＜0.01）。小鼠灌胃給予三七粉3天，能夠不同程度地減少小鼠扭體次數，與對照組比較，2.2 g·kg-1劑量組、4.4 g·kg-1劑量組作用顯著（P＜0.05，P＜0.01）；給予三七總皂苷3 天，亦能夠不同程度地減少小鼠扭體次數，與對照組比較，0.5 g·kg-1劑量組、1 g·kg-1劑量組作用顯著（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，高、中劑量的三七粉及三七總皂苷對醋酸所致的小鼠扭體反應有顯著抑制作用，鎮痛作用明顯，且具有一定量效關系（圖1）。

表1 三七粉及三七總皂苷對醋酸誘導小鼠扭體次數的影響（±s，n = 10）

表1 三七粉及三七總皂苷對醋酸誘導小鼠扭體次數的影響（±s，n = 10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別三七粉三七總皂苷陽性藥組對照組劑量（g·kg-1）1.1 2.2 4.4 0.25 0.5 1.0 0.12-扭體次數41.10±10.39 32.10±8.74*25.40±7.88**38.20±7.50 33.40±7.69*30.50±7.93**17.50±7.49**43.80±11.18

圖1 三七粉及三七總皂苷對醋酸誘導小鼠扭體次數的影響

2.2 三七總皂苷及單體化合物對LPS 誘導RAW264.7細胞炎癥反應的影響

2.2.1 三七總皂苷及14個化合物對細胞增值的影響

如圖2 所示，不同濃度三七總皂苷（PNS，0.8 μg·mL-1、4 μg·mL-1、20 μg·mL-1、100 μg·mL-1、500 μg·mL-1）刺激RAW264.7 細胞24 h 后，100 μg·mL-1和500 μg·mL-1給藥組的細胞增殖率與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.001），說明給藥濃度過高，對細胞增殖具有抑制作用，其余濃度無顯著差異。故選取0.2 μg·mL-1、2 μg·mL-1、20 μg·mL-1為后續三七總皂苷的給藥濃度。

圖2 不同濃度三七總皂苷給藥24h后對細胞增殖的影響

如圖3 所示，當不同濃度（1 μmol·mL-1、10 μmol·mL-1、50 μmol·mL-1、100 μmol·mL-1）的 三 七 皂 苷R1（N-R1）、人參皂苷Re（G-Re）、人參皂苷Rg1（GRg1）、人參皂苷Rg2（G-Rg2）、人參皂苷Rh1（G-Rh1）、人參皂苷Rb1（G-Rb1）、人參皂苷Rb2（G-Rb2）、人參皂 苷Rb3（G-Rb3）、三 七 素（Dencichine）刺 激RAW264.7 細胞24 h 后，各濃度組細胞增值率均大于90%且與空白對照組比較均無顯著性差異（P＜0.05），說明以上9 個單體化合物在1-100 μmol·mL-1給藥濃度范圍內對細胞增殖無影響，屬于安全給藥范圍。而人參皂苷Rd（G-Rd，P＜0.05）、人參皂苷Rg3（G-Rg3，P＜0.01）、人 參 皂 苷F2（G-F2，P＜0.001）、槲 皮 素（Quercetin，P＜0.01）的100 μmol·mL-1給藥組及人參皂苷Rk1（G-Rk1，P＜0.001）的50 和100μmol·mL-1給藥組細胞增值率與空白對照組比較顯著降低，因此以上5 個化合物在后續實驗中的最高給藥濃度設為10 μmol·mL-1。

圖3 不同濃度單體化合物給藥24 h后對細胞增殖的影響

2.2.2 三七總皂苷對細胞NO、TNF-α 和IL-6 釋放量的影響

三七總皂苷對RAW264.7 細胞上清液中NO、TNF-α、IL-6釋放量的影響（圖4），由圖可知，LPS刺激細胞后，細胞上清液中的NO、TNF-α、IL-6 表達量與空白對照組比較顯著增強（P＜0.001），說明LPS 誘導RAW264.7 炎癥模型建立成功。陽性對照地塞米松組（100 μmol·mL-1）細胞上清液中NO、TNF-α、IL-6 的含量與空白組比較有顯著性降低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01）。三七總皂苷高、中濃度組與模型對照組比較，能顯著降低細胞上清液中的NO、TNF-α、IL-6 含量（P＜0.05，P＜0.01），且表現出一定的濃度依賴性。

圖4 三七總皂苷與LPS共孵育24h對Raw264.7細胞培養上清液中NO（A）、TNF-α（B）、IL-6（C）釋放量的影響

2.2.3 14 個單體化合物對細胞NO、TNF-α 和IL-6 釋放量的影響

如圖5 所示，LPS 刺激細胞后，與空白對照組比較，細胞上清液中的NO、TNF-α、IL-6 分泌量著性增加（P＜0.001），說明LPS 誘導RAW264.7 炎癥模型建立成功。陽性藥地塞米松組（100 μmol·L-1）細胞上清液中NO、TNF-α、IL-6 的 含 量 顯 著 低 于LPS 組（P＜0.001）。

圖5 單體化合物與LPS共孵育24h對Raw264.7細胞培養上清液中NO（A、B）、TNF-α（C、D）、IL-6（E、F）釋放量的影響

與模型組比較，G-Rd、G-Rg3、G-Rk1 高濃度（10 μmol·L-1）以及G-Rg1、G-Rg2、G-Rb2、G-Rb3、三七素高濃度（100 μmol·L-1）對NO 有顯著抑制作用（P＜0.05）；G-F2 和槲皮素在中（1 μmol·L-1）、高（10 μmol·L-1）濃度以及N-R1、G-Re、G-Rh1、G-Rb1 在高（100 μmol·L-1）、中（10 μmol·L-1）濃度對NO 均有顯著抑制活性（P＜0.05）。與模型組比較，G-Rd、G-F2、G-Rk1、G-Rg1、G-Rg2、G-Rb2、G-Rb3、三七素僅在高濃度給藥組對細胞上清中TNF-α的含量有顯著抑制作用（P＜0.05），其它化合物在高、中濃度給藥組對TNF-α的釋放均有抑制作用。G-Rd、G-Rg3、G-Rk1、槲皮素、GRg2、G-Rb2、G-Rb3 在高濃度給藥組對IL-6 的釋放有顯著抑制作用（P＜0.05），其它化合物在高、中濃度給藥組對IL-6的釋放均有抑制作用。

3 討論

在基礎醫學研究中篩選鎮痛藥的常用致痛方法有物理法（熱、電、機械）和化學法?；瘜W法中采用腹腔注射乙酸可引起腹腔臟器出現化學性炎癥，產生內臟痛，行為學表現為：腹部凹陷、后肢外伸。扭體實驗操作簡單，不需使用麻醉劑，行為學明顯，且重復性好。因此本實驗采用此模型評價三七粉和三七總皂苷的鎮痛效果。已有研究發現[11]，三七總皂苷對化學性和熱刺激性引起的疼痛均有明顯的對抗作用，且三七總皂苷是一種阿片肽樣受體激動劑、不具有成癮的副作用；還可以顯著抑制星形膠質細胞活化，減少其釋放的促炎性因子和神經營養因子的釋放，抑制痛覺過敏和中樞敏化。本實驗研究發現，三七粉可劑量依賴性的降低醋酸誘導的小鼠疼痛反應，表現在降低小鼠的扭體產生次數。三七總皂苷為三七中富含皂苷成分的提取物，也可以劑量依賴性的降低小鼠扭體次數，表明三七總皂苷為三七鎮痛的有效部位。

現代醫學認為，軟組織損傷的最初反應是炎癥，消除炎性介質在抗炎過程中起到很重要的作用，而消除損傷伴隨的疼痛也是臨床治療的重要方面[12]。巨噬細胞生成于骨髓，為人體免疫系統主要反應細胞，可作為中心細胞啟動炎癥介質的產生，其具有吞噬外來物質、抗原呈遞和免疫調節的作用[13-14]。軟組織損傷后，大量的炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞等浸潤到損傷的局部組織，并產生導致持久炎癥和參與疼痛傳輸的大量炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNFα）、IL-6及PGE2等[15-16]。TNF-α具有很強的炎癥損傷作用，具有對IL-1β、IL-6 等的協調和調節作用；IL-6是由TNF-α、IL-1β 刺激后產生，主要由T、B 細胞與單核巨噬細胞分泌，能促進中性粒細胞活化和聚集，血清中IL-6 水平可反映組織損傷的程度。所以通過控制TNF-α、IL-6 等的產生，可以有效抑制炎癥的發展[17-19]。NO 是介導炎癥反應的關鍵因子，可殺滅侵入機體的病原微生物，維持機體正常的免疫防御功能。少量的NO 是維持正常細胞功能必不可少的物質，然而研究表明LPS、細胞因子等刺激因子能誘導單核巨噬細胞高表達一氧化氮合成酶（iNOS）從而合成過量的NO，造成細胞毒性和組織損傷等一系列炎癥反應[20-23]。因此，本實驗以LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型對三七總皂苷及14 個關鍵化學成分（包括原人參三醇型：三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1；原人參二醇型：人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1；黃酮類：槲皮素以及氨基酸類：三七素）進行了體外抗炎活性評價。結果表明，三七總皂苷及14個化合物能顯著降低LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中NO、TNF-α 和IL-6 的含量，顯示較好的抗炎效果，推測以上14個化合物（結構式見圖6）可能為三七粉發揮消腫定痛作用的關鍵藥效物質基礎，可作為三七粉消腫定痛功效的質量標志物。

圖6 14個化合物結構式