基于止血作用的三七粉質量標志物研究＊

李 新，徐 旭，許 浚，郭海彪，李曉霞，林 娟，張鐵軍＊＊，劉 旻＊＊

（1.天津藥物研究院/天津市中藥質量標志物重點實驗室 天津 300301；2.天津藥物研究院 中藥現代制劑與質量控制技術國家地方聯合工程實驗室 天津 300301；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510515；4.華北理工大學研究生院 唐山 063200）

中藥材是生產中藥飲片和中成藥的基本原料，其質量是保證中藥飲片和中成藥質量的關鍵和基礎。因此，中藥材質量的規范化是保證中藥材質量的重要措施和重要前提[1]。中藥質量評價模式目前呈現多元化發展趨勢，相關質量評價技術涵蓋多個領域的先進技術，如光譜、色譜、生物評價、多組學分析等。雖然中藥檢測與質量評價的指標較多，但呈現碎片化的狀態，與藥效的關聯不明確[2]。2016 年劉昌孝院士創造性地提出了中藥質量標志物（quality marker，QMarker）這一核心質量概念。該概念關聯安全性和有效性，著眼于中藥全過程的物質基礎的特有、差異、動態變化和質量的傳遞性、溯源性，并且具有整體、多元質控的特點[3-4]。

隨著中藥質量標志物研究的進展，近年來我國在中藥監管方面取得了一定的成效，為了更好地篩選中藥質量標志物，反映中藥的整體功效，張鐵軍等[5]對延胡索進行了示范性研究，通過初步探索建立一條比較完整的中藥質量標志物研究思路。研究發現延胡索植物成分中的生物堿主要由氨基酸途徑合成，特異性較強的成分在生源途徑下游的位置，再結合含量篩選出潛在的中藥質量標志物。中藥功效以網絡藥理學預測活性成分，從整體動物、器官、細胞、受體等多層面研究其信號通路，以仿生學和功能受體相結合進行物質篩選，再結合入血成分研究，最終確定7個延胡索的質量標志物。許多學者對諸多藥材做了較為全面的中藥質量標志物的預測研究，但飲片的質量標志物研究較少，沒有系統地進行探索[6],中藥飲片的不合格率仍然占有一定比例。

中藥三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根莖，產地為云南、廣西等地區，性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經，功效為散瘀止血、消腫定痛，主要用于治療外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等[7-8]，其主要特點為即有活血作用又有止血作用。三七的止血作用被廣泛應用在臨床中，主要應用于急性軟組織損傷、消化道出血、術后出血、婦科出血、腦出血等領域。宋振華等對60例急性軟組織損傷患者采用三七散治療可以快速改善臨床癥狀,急性期效果顯著[9]。趙巖等采用大黃三七粉治療消化道出血的病人，經過一個周期的治療后實驗組的有效率（96.00%）遠高于對照組（76.00%）[10]。鄭丹丹等觀察三七重樓生化湯聯合二次剖宮產術中子宮瘢痕切除對預防子宮切口憩室（PCSD）形成的作用，發現治療后血性惡露持續時間和子宮收縮痛評分減低[11]。彭皇青等采用白及三七散治療先兆流產中陰道出血100 例，陰道出血停止時間、腰痛緩解時間及腹痛緩解時間均短于對照組[12]。隆康健等采用三七白及散治療丘腦出血41 例，總有效率（87.8%）明顯高于對照組（62.5%）,出血持續時間短于對照組,應激性潰瘍發生率、神經功能評分、血漿皮質醇、ACTH 水平較對照組顯著降低,差異均有統計學意義（P＜0.05）[13]。

三七藥材經分離鑒定，其主要化學成分為皂苷類，化學結構復雜，同時含有黃酮、甾醇、糖、揮發油、聚炔醇、氨基酸和有機酸等類化學成分[14-15]。2020 年版《中華人民共和國藥典》記載三七含量測定以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1為指標[16]。本課題組前期研究三七成分對凝血指標TT、APTT、PT、FIB，以及血小板聚集率、血管動脈條收縮功能等的影響，研究發現三七中人參皂苷F2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rk1、槲皮素等，包括《中華人民共和國藥典》記載的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1等均具有抗凝活血作用，表明《中華人民共和國藥典》標準中沒有明確止血成分。本研究在前期網絡藥理學、入血成分研究及基于活血作用質量標志物研究基礎上，對三七超微粉中單體成分的止血作用進行考察，探索三七超微粉基于止血作用的質量標志物。

1 實驗材料

三七素（批號：R05N10F102244）和人參皂苷Rb2（批號：P15O10F94983）購自上海源葉生物科技有限公司，用于縮血管研究。三七素以磷酸緩沖液（PBS）配制成儲備液，人參皂苷Rb2以二甲基亞砜（DMSO）配制成儲備液。

試劑盒：凝血酶時間（TT）（批號：031906A）、活化部分凝血酶原時間（APTT）（批號：021908A）、凝血酶原時間（PT）（批號：011710A）、纖維蛋白原（FIB）（批號：041904B）試劑盒均購自美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司。試劑：二磷酸腺苷（ADP）（批號：SLCB5611）購自Sigma 公司；去氧腎上腺素（苯腎上腺素，PE）（批 號：MTBXK-CP）購 自Tokyo chemical industry公司。

儀器：凝血因子分析儀（LG-Paker 1），北京普利生儀器有限公司；血小板聚集儀（型號：540VS），美國Chrono-log 公司；JZ301 型微張力換能器，北京新航興業科貿有限公司；MP-150 多導生理信號記錄儀、DA100C 通用放大器，Biopac 公司；HSS-1B 型離體器官恒溫裝置，成都儀器廠。

動物：家兔，北京隆安實驗動物養殖中心，生產許可證號：SYXK（京）2019-0009。

2 實驗方法

2.1 對凝血指標的影響

家兔6 只，雄性，適應性喂養一段時間后，禁食過夜，頸總動脈取血，枸櫞酸鈉抗凝，在3000 rpm 離心10 min 制備血漿，在兔血漿中加入三七素樣品（以DMSO配制），濃度分別為0.05、0.5、5、50、100、500、1000 μM；分別設空白對照組和DMSO 對照組。采用凝血記錄儀，依據試劑盒說明書操作，測定TT、APTT、PT、FIB。

2.2 對血小板聚集率的影響

家兔6 只，雄性，適應性喂養一段時間后，禁食過夜，頸總動脈取血，枸櫞酸鈉抗凝，在1000 rpm 離心10 min 制備富含血小板血漿；在3000 rpm 離心10 min 制備貧血小板血漿。在兔血漿中加入三七素藥物樣品（以雙蒸水配制），濃度分別為0.05、0.5、5、50、100、500、1000、2000 μM，預孵10 min 后加入ADP，終濃度為6 μM；溶劑對照組加入等體積雙蒸水。采用比濁法，測定血小板聚集率。

2.3 對血管平滑肌的影響

藥物配制：人參皂苷Rb2以DMSO 配制成50 mM儲備液，隨后分別用DMSO 稀釋為所需濃度。三七素以雙蒸水配制為50 mM 儲備液，隨后分別用雙蒸水稀釋為所需濃度。

營養液（Krebs-Henseleit 液）組成：NaCl 119 mM、KCl 4.7 mM、MgCl21.2 mM、NaHCO312.0 mM、NaH2PO41.2 mM、葡萄糖11 mM和CaCl22.5 mM。

動脈條制備：家兔6 只，雄性，適應性喂養一段時間后，禁食過夜，戊巴比妥鈉麻醉，頸總動脈放血后，迅速開胸取胸主動脈，置于預冷生理鹽水中剝離血管表面筋膜，用小眼科剪將主動脈剪成若干螺旋條。

血管反應性檢測：將動脈條置于組織灌流系統37℃恒溫水浴槽中，營養液完全浸沒，給予混合氣體；動脈條下端固定，上端鏈接張力換能器，計算機采集張力變化數據。營養液中加入去氧腎上腺素，終濃度為0.5 mg·L-1，使動脈條發生收縮反應，待張力達到最大并穩定至一平臺后，用營養液洗凈，待血管環張力恢復到基線，準備進行下一步實驗。

藥物作用檢測：組織灌流系統穩定后，營養液中再加入去氧腎上腺素，終濃度為0.5 mg·L-1，血管條收縮，張力增加，張力曲線上升，待曲線上升平穩后加入待測樣品，終濃度分別為1、5、25 μM；另設蒸餾水對照組和DMSO對照組；待曲線穩定后，測量加藥前后曲線變化值，即張力變化值。

數據分析：以去氧腎上腺素誘導的血管收縮平穩時的數值為基準，正數代表血管繼續收縮，而負數代表血管舒張。

3 實驗結果

3.1 對凝血指標的影響

3.1.1 對TT的影響

首先考察了同等體積的DMSO 對體系的影響，發現DMSO 對本體系中TT 有顯著延長作用（P＜0.01）；與DMSO 溶劑對照組比較，三七素可劑量依賴性降低血漿TT，500-1000 μM內效果顯著（P＜0.01）（圖1）。

圖1 三七素對TT的影響

3.1.2 對APTT的影響

首先考察了同等體積的DMSO 對體系的影響，發現DMSO對本體系中APTT有顯著延長作用（P＜0.01）；與DMSO 溶劑對照組比較，三七素500 和1000 μM 可顯著縮短血漿APTT（P＜0.01）（圖2）。

圖2 三七素對APTT的影響

3.1.3 對PT的影響

首先考察了同等體積的DMSO 對體系的影響，發現DMSO 對本體系中PT有延長的趨勢，但統計上無顯著性差異（P＞0.05）；與DMSO 溶劑對照組比較，三七素100-1000 μM 可劑量依賴性的縮短血漿PT（P＜0.05，P＜0.01）（圖3）。

圖3 三七素對PT的影響

3.1.4 對FIB的影響

首先考察了同等體積的DMSO 對體系的影響，發現DMSO 對本體系中FIB 含量有顯著降低作用（P＜0.01）；與DMSO 溶劑對照組比較，三七素50-2000 μM以 上 可 劑量 依 賴性 的 增 加FIB 含 量（P＜0.05，P＜0.01）（圖4）。

圖4 三七素對FIB的影響

3.2 對血小板聚集率的影響

家兔富含血小板血漿中加入三七素可不同程度地誘導血小板聚集。與溶劑對照組比較，三七素1000-2000 μM時可顯著增加血小板聚集率（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。

圖5 三七素對ADP誘導家兔血小板聚集的影響

3.3 對血管平滑肌的影響

與對應的溶劑對照組比較，三七素1 μM 濃度時可顯著收縮血管動脈條（P＜0.01），人參皂苷Rb2在5 μM濃度時可顯著收縮血管動脈條（P＜0.05），在25 μM時則具有擴張血管的趨勢（P＞0.05）（圖6）。

圖6 人參皂苷Rb2、三七素對PE誘導離體家兔主動脈環收縮的影響

4 討論

質量是中藥產業的生命線，近年來由于中藥材品質的影響，國內外業界對中醫藥的安全性和有效性提出諸多質疑，中藥質量成為行業關注的焦點，嚴重影響了中醫藥的聲譽。中藥質量標志物是中藥質量標準中的核心要素，是控制中藥材、飲片、提取物及制劑內在質量的關鍵，是中藥現代化、國際化的瓶頸之一。劉昌孝院士提出的中藥質量標志物是質量評價的核心概念，是以藥材基原為研究基礎、以物質基礎研究為支撐、以Q-markers 辨析為核心、以質控方法為手段，構建符合中藥特色的質量控制標準，正逐步成為中藥質量控制新模式[17]。

由于中藥的功效是在中醫藥基礎理論指導下對中藥預防、治療作用的高度概括。以中藥的功效研究為基礎，發掘中藥的功效標志物對中藥現代化也具有重要的意義。進行中藥功效標志物的識別，理清其作用機制，網絡藥理學、系統生物學、系統藥理學等新興學科、交叉學科發展迅速，數據挖掘、分子模擬、生物網絡等新興技術逐漸被引入[18]。本課題前期血清移行成分的分析鑒定了三七超微粉入血的原型成分及代謝產物，并根據原型成分和查閱文獻共同確定的化合物進行了網絡藥理學的分析。結合兩者結果，本課題選取了多個單體化合物進行了凝血指標實驗、血小板聚集實驗、血管平滑肌實驗、心肌和血管保護實驗、消腫定痛實驗等，進行活性化合物的篩選，構建了不同的體外細胞模型、體內動物模型和離體模型，分別得到三七超微粉發揮不同作用的標志性成分，其中包括活血成分和止血成分。本文闡述了止血成分的實驗結果。

《本草綱目新編》中記載：“三七根，止血之神藥也。”三七的止血功效是學界公認的功效。三七止血一般生用，因三七氨基酸不穩定，經蒸燙炸后易分解。石瑩等采用改良的Feeney 自由落體模型制備法建立創傷性腦損傷（TBI）大鼠模型，于術前3 天至術后3 天灌胃三七粉2.5 g·kg-1，結果三七粉能改善72 h 神經功能缺陷評分，同時HE 染色和Nissl 染色腦組織損傷較模型組改善，透射電鏡下腦細胞中可見自噬體減少，泛素結合蛋白p62、Beclin1 和微管相關蛋白輕鏈3（LC3）均明顯下降（P＜0.05或0.01），說明干預TBI大鼠自噬過程，能促進腦功能恢復[19]。雷霆等采用高脂高糖飼料喂養、一次性腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，再以磁鐵壓軋大鼠背部制作潰瘍創面造成糖尿病足潰瘍（DFU）模型，并給予三七/白及膠海綿紗布覆蓋創面進行干預治療，每1-2 天換藥1 次，干預治療后第3、7 天時，與模型組分別比較，發現三七/白及膠海綿組大鼠創面愈合率顯著升高（P＜0.05）；創面組織的炎細胞浸潤、膠原纖維沉積、毛細血管和肉芽組織生長均明顯增加；β-連環素（β-catenin）、R-脊椎蛋白3（Rspo3）的mRNA 表達水平均有升高，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）的mRNA 表達水平降低（P＜0.05），表明三七/白及膠海綿可有效促進DFU 模型大鼠潰瘍創面愈合，作用機制可能與GSK-3β 的mRNA 表達的下調和β-catenin、Rspo3的mRNA表達的上調相關[20]。

止血過程與凝血因子、血小板、血管收縮等有關。凝血是一系列凝血因子相繼酶解激活，最終纖維蛋白原激活生成纖維蛋白凝塊，使血液由流動狀態轉變為凝膠狀態的過程，包括內源性凝血途徑、外源性凝血途徑和共同凝血途徑（圖7）。APTT 是臨床上篩選內源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ缺乏的首選實驗。有出血癥狀的單因子缺乏患者及手術和創傷后的異常出血等均需要了解凝血因子的缺乏程度[21]。PT 用于外源性凝血途徑的篩選性實驗和凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ缺乏的篩選，用于定量測定及口服抗凝劑治療的監控[22]。TT 測定適用于檢驗共同凝血途徑的篩選試驗，反映纖維蛋白原轉為纖維蛋白的時間。纖維蛋白原是凝血過程中的主要蛋白質，在凝血酶、血纖維穩定因子（FXⅢa）、Ca2+等凝血因子的作用下形成纖維蛋白單體，并相互共價結合形成纖維蛋白多聚體，形成穩定的纖維蛋白網，最終網羅紅細胞（RBC）、血小板（PLT）等成分形成穩定血栓結構。本研究發現三七中的三七素可顯著縮短APTT、TT、PT 時間，提高血漿中FIB含量,是三七促凝作用的物質基礎。

圖7 凝血途徑

血小板在正常生理血液中是靜息的，血小板活化功能亢進是血栓形成的主要病理機制之一。受多重因素的影響血小板被激活，血小板和纖維蛋白原聚集成團，最終導致血栓形成及血管的閉塞。鄺晶等采用腦出血大鼠模型，給予大鼠灌胃三七后大鼠出血量、血腫程度和梗死面積明顯比模型組少或減輕，血管組織中血小板活化因子CD62P的表達量明顯下調[23]。本實驗發現三七素可誘導血小板聚集，是三七促血小板聚集發揮止血作用的物質基礎。

人工全髖關節置換（THA）術后會較大量失血，同時關節的積血腫脹增加了術后感染幾率，也影響患者的康復鍛煉。如何減少THA 術后失血，爭取做到不輸血是目前關注的焦點。臨床上有術中關節腔內注射腎上腺素、術后彈力繃帶加壓包扎、冰敷等引起血管收縮或造成血管腔變小的方法來減少THA 術后出血。肖署陽等選取人工全髖關節置換術患者30 例，于前1天和術后連續3 天口服三七止血湯，結果顯示三七止血湯能顯著減少人工全髖關節置換術的總失血量、顯性失血量及隱性失血量，輸血患者數量和輸血量明顯降低，可顯著減少人工全髖關節置換術圍手術期失血[24]。本研究發現人參皂苷Rb2在25 μM濃度時，可顯著收縮血管；三七素在1 μM 濃度時，可顯著收縮血管，表明人參皂苷Rb2、三七素是三七縮血管發揮止血作用的物質基礎。

綜上所述，三七止血作用主要表現在促凝血、促血小板聚集、血管收縮等方面。促凝血、促血小板聚集作用的物質基礎主要是三七素，縮血管作用的物質基礎主要是三七素（圖8）、人參皂苷Rb2（圖9）。

圖8 L-三七素

圖9 人參皂苷Rb2