三七粉血清藥物化學研究＊

劉耀晨，王德勤，張洪兵，郭海彪，韓彥琪，林 娟，張鐵軍，5＊＊，許 浚，5＊＊

（1.天津醫科大學藥學院 天津 300070；2.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510515；3.天津藥物研究院天津市中藥質量標志物重點實驗室 天津 300301；4.天津藥物研究院中藥現代制劑與質量控制技術國家地方聯合工程實驗室 天津 300301；5.天津藥物研究院釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室 天津 300301）

三七為五加科人參屬植物三七Panax notoginseng(Burk.) f.H.Chen 的干燥根和根莖，收載于《中國藥典》，傳統功效為活血化瘀、消腫止痛[1]。三七中以皂苷類有效成分為主，還含有多種非皂苷類成分，如糖類、氨基酸、黃酮類等[2]。三七粉是將三七藥材經粉碎而成，作為中藥飲片主要用于外傷出血、胸腹刺痛及跌撲腫痛等[3]。三七粉的質量標準主要參考《中國藥典》，但現行《中國藥典》質量標準僅規定了三七粉中人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的含測總量[1]，相關研究表明，三七皂苷成分主要與活血、抗炎、免疫調節、神經保護等藥理作用相關[4-10]。因此，現行標準不能真正反映三七粉質量與療效的關系。

為解決我國中藥質量標準存在的問題，劉昌孝院士提出中藥質量標志物（Q-Marker）的概念，明確了QMarker 的基本條件，Q-Marker 研究應對中藥有效成分的傳遞和轉化過程進行研究[11,12]。三七粉以口服用藥的形式通過體內傳輸發揮臨床療效，化學物質基礎經過質量傳遞和代謝轉化后體現出其特有的生物效應。入血成分及其代謝產物是三七粉最終的“效應成分”。從質量傳遞與溯源的角度,血中的效應成分是質量傳遞體系的最終環節,也是中藥質量標志物確定的重要依據[13]。因此，必須明確三七粉體外化學成分組-體內血行成分組的傳遞-轉化過程，為三七粉藥效物質基礎的傳遞過程提供清晰的路徑。目前三七皂苷成分表征及單體皂苷的代謝轉化研究已有報道[14-20]，但缺乏三七粉化學物質組及其體內血行成分組的表征。

本研究建立三七粉的化學指紋譜，運用液質聯用技術對所含化學成分進行了全面分析；隨后結合血清藥物化學方法建立給藥血漿的血行成分指紋譜，分析血中移行的原型藥物成分及代謝物，明確體外化學成分組-體內血行成分組的藥效物質基礎傳遞-轉化過程，為三七粉的質量標志物確定與全面質量控制提供依據。同時為課題組后期深入三七粉分子作用機制，從成分的“有效性”方面框定其質量標志物奠定基礎。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

Acquity UPLC 超液相色譜儀（美國Waters 公司）；Xevo G2 Q-Tof 高分辨質譜（美國Waters 公司），配備ESI 離 子 源；Acquity UPLC BEH C18（2.1×100 mm, 1.7 μm）色譜柱（美國Waters 公司）；HAC-Ⅰ自動濃縮氮吹儀（天津市恒奧科技有限公司）；3K15高速冷凍離心機（德國Sigma公司）

1.2 試藥

對照品人參皂苷Re（批號110754-201827）、人參皂苷Rd（批號111818-201603）、人參皂苷Rg1（批號110704-201827）、三七皂苷R1（批號10745-201820）均購于中國食品藥品檢定研究院，人參皂苷Rc（批號M29F11S109055）購自上海源葉生物科技有限公司，所有對照品質量分數均大于98%；色譜純乙腈、甲醇和甲酸購自天津市康科德科技有限公司；純凈水購自杭州娃哈哈飲用水有限公司；三七粉購自廣州白云山和記黃埔中藥有限公司（批號YPA8L0006）。

2 方法

2.1 三七粉樣品溶液制備

取三七粉1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇10 mL，超聲提取20 min，重復2 次合并提取液，以70%甲醇稀釋至25 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得三七粉樣品溶液供檢測分析。

2.2 三七粉大鼠灌胃溶液制備

取三七粉適量，加入羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液，并稀釋至濃度為0.3 g·mL-1，即得。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取適量人參皂苷Re、Rd、Rg1、Rc 和三七皂苷R1，置于量瓶中，加入甲醇，制備成0.1 mg·mL-1各對照品儲備液；分別量取上述儲備液適量，稀釋，制備成均為10 μg·mL-1的混合對照品溶液。4℃下保存，進樣前經0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.4 含藥血清制備與處理

2.4.1 給藥與采血

雄性SD 大鼠（200±20 g），飼養1 周后，隨機分為兩組并稱定體重，按1 mL/100 g的灌胃劑量，空白組給予羧甲基纖維素鈉溶液，給藥組灌以三七粉混懸液。

實驗大鼠給藥4 h 后以10%水合氯醛麻醉，肝門靜脈取血置肝素化試管中，于4℃條件下3500 rpm 離心10 min分離血漿，置-20℃冰箱中保存備用。

2.4.2 血漿樣品的處理

取大鼠血漿樣品500 μL，加入甲醇，混勻，于4℃條件下13000 rpm 離心10 min，上清液使用N2吹干，殘渣以甲醇復溶，離心吸取上清液供檢測分析。

2.5 LC-MS分析

色譜分析采用Waters Acquity UPLC 液相色譜系統，色譜柱為Waters Acquity UPLC? BEH C18（2.1×100 mm,1.7 μm）柱，流動相系統由A（0.1%甲酸乙腈）和B（0.1%甲酸水溶液）組成，流速0.4 mL·min-1，柱溫45℃，進樣量5 μL。運用梯度洗脫，梯度程序設置如下：0-3 min，8%-20% A；3-6 min，20%-25% A；6-16 min，25%-40%A；16-22 min，40%-65%A；22-26 min，65%-75%A；26-27 min，75%-95%A。

質譜分析采用Waters Xevo G2 Q-Tof 高分辨質譜，配備電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓正離子模式3.0 kV，負離子模式2kV。離子源溫度110℃，樣品錐孔電壓30V，錐孔氣流速50 L·h-1，氮氣脫氣溫度350℃，脫氣流速800 L·h-1，掃描范圍50-2000m/z，內參校準液亮氨酸腦啡肽用于分子量實時校正。

2.6 數據處理

2.6.1 三七粉化學成分鑒定

通過標準品參照、文獻檢索和數據庫檢索，對比分析正負模式下的MS、MS/MS 數據信息，結合保留時間、峰強度等對各色譜峰進行結構鑒定與確證，明確三七粉中所含的化學成分。

2.6.2 入血原型成分及代謝產物鑒定

通過比對三七粉樣品、大鼠給藥血漿及空白血漿樣品的色譜圖，結合標準品色譜圖和文獻檢索，對比各色譜峰的MS、MS/MS 數據信息，對三七粉吸收入血的原型成分進行結構鑒定；進一步分析原型成分的裂解規律，結合碎片離子的特征中性丟失，比對相關代謝產物的MS、MS/MS質譜信息，對其結構進行鑒定，明確體內代謝途徑。

3 結果與分析

3.1 三七粉樣品分析

采用“2.5”項下優化的條件，對三七粉樣品溶液進行檢測分析，正、負離子模式下，三七粉樣品及混合對照品的BPI 色譜圖（圖1-圖2）。按照“2.6.1”項下數據處理方法確定化學成分結構，對三七粉主要化學成分進行表征，共鑒定得到54個化合物（表1），其中原人參二醇皂苷類36 個，原人參三醇皂苷類14 個，黃酮類1個，糖類1 個，氨基酸類1 個和酯類化合物1 個。

圖1 三七粉BPI色譜圖

圖2 混合對照品負離子模式BPI色譜圖

表1 三七粉化學成分LC-MS數據

3.1.1 皂苷類

三七粉中皂苷類化合物，結構中含有葡萄糖、鼠李糖等多個糖基取代，在質譜中容易逐級丟失產生一系列特征碎片離子，進一步斷裂C-17 支鏈取代烷基，形成84 Da的特征中性丟失[16]。

原人參二醇型皂苷類化合物，以人參皂苷Rb1為例，其C-3 位和C-20 位羥基均有二糖取代，分別由兩分子葡萄糖2→1 位相連和兩分子葡萄糖6→1 位相連。在質譜中分子離子[M-H]-m/z1107連續丟失四分子葡萄糖，形成m/z945、m/z783、m/z621 的碎片離子及m/z459 的原人參二醇型皂苷元離子，進一步失去C-17 支鏈產生m/z375 的碎片離子，所得碎片信息與文獻數據一致，MS/MS譜圖見圖3。

圖3 人參皂苷Rb1的MS/MS譜圖

續表

原人參三醇型皂苷類化合物，以三七皂苷R1為例，C-6 位羥基由一分子葡萄糖與一分子木糖2→1 位相連取代，C-20位羥基被一分子葡萄糖取代。在質譜中，[M-H]-m/z931的分子離子連續丟失一分子木糖和兩分子葡萄糖，形成m/z799、m/z637 的碎片離子及m/z475 的原人參三醇型皂苷元離子，進一步斷裂C-17烷基支鏈失去84 Da，產生m/z391的碎片離子所得，碎片信息與文獻數據一致，MS/MS譜圖見圖4。

圖4 三七皂苷R1的MS/MS譜圖

3.1.2 氨基酸類

正離子模式下檢測到三七素[M+H]+m/z177 的分子離子，丟失一分子NH3和H2O 產生m/z160 和159 碎片離子，m/z159 碎片離子丟失一分子CO 產生m/z131碎片離子，m/z160碎片離子可發生重排并丟失一分子CO2產生m/z116 關鍵碎片離子，所得碎片信息與文獻數據一致[21]，MS/MS譜圖見圖5。

圖5 三七素的MS/MS譜圖

3.1.3 黃酮類

正離子模式下檢測到槲皮素[M+H]+m/z303 的分子離子，可丟失一分子H2O 形成碎片m/z285 碎片離子，繼續丟失一個CO產生m/z257 碎片離子[22]，所得碎片信息與文獻數據一致，MS/MS譜圖見圖6。

圖6 槲皮素的MS/MS譜圖

3.2 三七粉血漿樣品分析

采用“2.5”項下優化的條件，對三七粉、大鼠空白血漿及給藥血漿樣品進行檢測分析，負、正離子模式下，三七粉、大鼠空白血漿和給藥血漿樣品的BPI色譜圖如圖7、圖8 所示。按照“2.6”項下數據處理方法確定化學成分結構，在給予三七粉的大鼠血漿中共鑒定得到14 個吸收原型藥物成分和4 個代謝物（表2-表3）。

圖7 負離子模式BPI色譜圖

圖8 正離子模式BPI色譜圖

表2 三七粉吸收入血原型成分LC-MS數據

表3 三七粉大鼠血漿代謝物LC-MS數據

3.2.1 三七粉血漿樣品代謝物鑒定

吸收入血的原型藥物成分在體內不同藥物代謝酶的作用下，經過Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應，原型成分的化學結構和精確質量數都會被改變。然而，絕大多數代謝物仍然保留了其原型的結構特征，通過分析裂解規律來進行代謝物的鑒定。

M1在負離子模式下產生[M-H]-m/z475的分子離子及m/z391 的碎片離子，形成84 Da 的特征中性丟失，被鑒定為原人參三醇。M2 的在質譜圖中具有與M1 一致的裂解行為，但其分子離子[M-H]-m/z473 比M1小2 Da，推測為脫氫原人參三醇。

M3在負離子模式下顯示[M-H]-m/z459的分子離子，失去84 Da 產生了m/z375 的碎片離子，質譜裂解行為與原人參二醇一致，因此被鑒定為原人參二醇。

M4 在質譜圖中顯示[M+Na]+m/z645 的分子離子，正離子模式下丟失一分子葡糖糖和一分子水，產生[M+Na-glc-H2O]+m/z465 和[glc+H2O+Na]+m/z203 的碎片離子，經與文獻比對鑒定為人參皂苷C-K[23]。

4 討論

本研究中，采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 的技術方法，優化液相色譜、質譜分離檢測條件，建立三七粉指紋譜分析所含化學成分，經與標準品和文獻數據比對，分析其質譜裂解規律，結果在三七粉樣品中共鑒定得到54 個化學成分，以皂苷類化合物為主，包括原人參二醇皂苷類36 個，原人參三醇皂苷類14 個，黃酮類1個，糖類1個，氨基酸類1個和酯類化合物1個。

在三七粉化學成分研究的基礎上，進一步建立給藥血漿的血行指紋譜，通過比對三七粉、大鼠給藥血漿及空白血漿樣品的色譜圖，篩選分析血中移行的原型藥物成分及代謝物，結果在大鼠血漿中共鑒定得到18個三七粉相關的外源性化合物，包括14個吸收原型藥物成分和4個代謝物。吸收原型藥物成分中原人參三醇皂苷類有6 個分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg2、人參皂苷F1；原人參二醇皂苷類有6 個，分別為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷F2、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rk1、三七皂苷Fa；氨基酸類成分有1個為三七素；黃酮類成分有1 個，為槲皮素。代謝物中原人參二醇和人參皂苷C-K 來源于原人參二醇型皂苷；原人參三醇和脫氫原人參三醇來源于原人參三醇型皂苷[24]。在給藥大鼠血漿中檢測到的吸收原型成分及其代謝產物可能是三七粉潛在真正的活性成分，并與三七粉的藥理作用直接相關，為后期課題組進行三七粉傳統功效的作用機制研究奠定基礎，它們作為三七粉最終的“效應成分”可作為其質量標志物的候選。