熒光光譜法探究幾種金屬離子與牛血清白蛋白的相互作用

彭婷婷

（白城師范學院 化學學院，吉林 白城137000）

0 引言

金屬離子在生命進程中起著重要的作用，它可以參與基因表達和酶催化反應，亦可參與人體的生長發育、新陳代謝等重要的生理活動.其在生命體內維持一定的濃度，對生理活動起著不可或缺的作用.血清蛋白是血漿里最豐富的蛋白質，擔負著攜帶、運輸各種小分子物質的功能［1］.牛血清白蛋白（BSA）與人血清白蛋白具有高度的同源性，且BSA 價格較低，常用作為研究模型［2］.本文在模擬人體生理環境下，利用熒光光譜法初步明確了Ni2+，Mg2+，Ca2+和Cu2+與牛血清白蛋白的相互作用機制，能為評價這四種金屬離子在生物體內的吸收、代謝提供一定的參考.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55 型熒光光譜儀（購自美國珀金埃爾默公司）；BSA（購自北京鼎國昌盛生物技術公司）用三次蒸餾水溶解配制成5.68×10-5mol·L-1的儲備液，于冰箱中4 ℃保存備用；pH=7.40 的Tris 緩沖溶液；其他試劑均為分析純，實驗使用二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

在pH 為7.40的Tris緩沖溶液中加入固定量5.68×10-5mol·L-1的BSA 溶液，改變金屬離子的濃度.金屬離子-BSA 體系熒光光譜在λem=350 nm，λex=279 nm 處，激發狹縫寬度為10 nm 和發射狹縫寬度為5 nm，波長范圍為300～400 nm時，體系在21 ℃和37 ℃下測定熒光發射光譜.

2 結果與討論

BSA的熒光主要來自色氨酸殘基和酪氨酸殘基，當其附近微環境發生變化，BSA的內源熒光強度會發生變化.

2.1 BSA與金屬離子作用的熒光光譜

BSA 與不同物質的量濃度的Ni2+，Mg2+，Ca2+和Cu2+溶液在溫度為294 K 時的熒光光譜如圖1所示.由圖1 可知，隨著溶液中各金屬離子濃度的增大，BSA 位于350 nm 附近的熒光峰強度有規律地減弱，金屬離子在300～400 nm 范圍內不發射熒光，表明金屬離子能夠猝滅BSA 的內源性熒光.隨著Ni2+，Cu2+濃度增加，色氨酸殘基和酪氨酸殘基的最大發射波長略有紅移，說明這兩種殘基所處的微環境極性增加，疏水性降低［3］.

圖1 BSA與金屬離子作用的熒光光譜

2.2 金屬離子對BSA內源熒光的猝滅類型

熒光猝滅可分為動態猝滅和靜態猝滅［4］，BSA 熒光猝滅可用斯特恩-沃爾默（Stern-Volmer）方程［5］進行描述，即：

其中：F0和F分別為未加入和加入金屬離子時BSA 的熒光強度；［D］為金屬離子的濃度；由實驗數據計算出不同金屬離子對BSA 的熒光猝滅的動態猝滅常數KSV，如表1 所示.根據Stern-Volmer 方程作圖，如圖2所示，高溫斜率大于低溫斜率為動態猝滅；反之，則為靜態猝滅［6-7］.由圖2和表1可知，F0/F與［D］間存在著良好線性關系；Ni2+，Mg2+離子存在時，KSV（294 K）＞KSV（310 K），可知Ni2+，Mg2+離子對BSA的熒光猝滅類型為靜態猝滅；Ca2+，Cu2+離子存在時，KSV（310 K）＞KSV（294 K），可知Ca2+，Cu2+離子對BSA的熒光猝滅類型為動態猝滅.

表1 BSA與金屬離子作用的猝滅常數、結合常數及結合位點數

圖2 BSA與金屬離子相互作用的Stern-Volmer曲線

2.3 BSA與金屬離子作用的猝滅常數、結合常數及結合位點數

金屬離子與牛血清白蛋白之間的結合常數和結合位點數可由方程（2）進行計算：

其中：［Q］為金屬離子的濃度；KA為結合常數；n為結合位點數.由表1 可知，294 K 時四種金屬離子與BSA 結合作用強度大小為KA（Cu2+）＞KA（Ca2+）＞KA（Mg2+）＞KA（Ni2+）.Cu2+結合常數最大，表明其與BSA形成配合物最穩定.310 K 時四種金屬離子與BSA 結合常數均增大，說明溫度升高，四種金屬離子與BSA 作用均增強.四種金屬離子與BSA 的結合位點數均小于1，說明四種金屬離子與BSA 只有一個結合位點.

2.4 BSA與金屬離子作用的熱力學參數及作用力類型

小分子與蛋白質結合的作用力類型通過熱力學參數可以確定，公式為

其中：KA1，KA2分別為T1，T2溫度下的結合常數.當ΔH＜0或ΔH≈0，ΔS＞0時，主要的作用力是靜電結合；當ΔH＜0，ΔS＜0時，主要作用力是范德華力或者氫鍵；當ΔH＞0，ΔS＞0時，主要作用力是疏水鍵［8］.

根據公式（3）～（5）計算得出的熱力學參數如表2所示.由表2可知，Ni2+與BSA 間的作用力主要是范德華力或者氫鍵；Mg2+，Ca2+，Cu2+與BSA間的作用力主要是疏水鍵.

表2 BSA與金屬離子作用的熱力學參數

3 結論

Ni2+，Mg2+，Ca2+和Cu2+都可以與BSA 發生作用，使得BSA 的內源熒光強度降低.實驗結果可得出BSA與金屬離子相互作用的強弱順序為KA（Cu2+）＞KA（Ca2+）＞KA（Mg2+）＞KA（Ni2+）.