河北邢臺及周邊地區豬偽狂犬病野毒流行情況調查及分析

葛生虎，齊曉亮，張 智

（1.河北銘諸生物科技有限公司，河北 邢臺 054000；2.邢臺市農業農村局動物疫病預防控制中心，河北 邢臺 054000）

豬偽狂犬病（Pseudorabies, PR）在我國豬場相對較為常見，該病由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）感染而引起，豬群感染該病后可出現發熱、神經癥狀、腹瀉及繁殖障礙等臨床癥狀，且不同發育階段豬群臨床癥狀差異較大[1]。盡管PRV的自然宿主是豬，但該病原可感染多種哺乳動物，其中包括犬科動物（犬、狐貍、貉和狼等）、反芻動物（牛、羊等）和嚙齒動物（鼠）等，因此該病的廣泛流行給相關經濟動物養殖業（如牛、羊和狐貍等）健康發展造成巨大的威脅[2]。此外，已有研究表明，PRV可能具有感染人的能力，Liu等首次從病人腦脊液中成功分離PRV變異株，提示PRV具有向人群的跨物種傳播能力，這無疑對養豬工作人員和消費者健康造成潛在威脅[3]。

得益于PRV基因缺失疫苗和相應檢測技術的廣泛應用，我國豬場PRV流行情況得到較好的控制，但當前廣泛使用的Bartha-K61疫苗對PRV變異株防控能力有限，導致我國豬場PR防控壓力較大，甚至部分豬場仍然流行PRV野毒。為初步調查河北省部分地區PRV野毒流行情況及毒株基因型，筆者于2021年3—10月從河南部分地區共收集114份疑似感染PR病豬組織樣品，通過分子生物學技術確定以上樣品PRV野毒感染率，同時對部分樣品gE基因序列進行擴增與分析，初步確定流行毒株的遺傳變異情況及基因型，旨在為該地區PR的防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2021年3—10月從河北邢臺及周邊地區收集疑似感染PR病豬組織樣品（淋巴結、扁桃體和腦等組織）114份，病豬臨床癥狀主要包括仔豬腹瀉、神經癥狀等，繁殖母豬流產及死胎等。所有豬場均對豬群免疫接種過PRV gE基因缺失弱毒/滅活疫苗。

1.2 臨床病料處理及檢測

采用滅菌眼科剪和手術刀剪取約0.5 g組織樣品，加入少量滅菌PBS溶液后研磨勻漿，凍融3次后以12 000 r/min離心5 min，取200 μL上清液用于DNA/RNA基因組提取，基因組提取步驟嚴格按照試劑盒說明進行。采用商業化PRV-gE real-time PCR檢測試劑盒對樣品中目的基因進行檢測，若樣品CT值低于35則判定為PRV野毒陽性，CT值高于35則判定為陰性。

1.3 PCR擴增PRV-gE基因序列

選擇3份PRV陽性樣品（CT值＜25）用于后續試驗，以PCR法對gE基因全長序列進行擴增，其擴增引物序列見參考文獻[4]。PCR擴增體系（25 μL）包括2×PCR預混液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板3.0 μL及滅菌蒸餾水8.5 μL；反應條件為98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環；72 ℃ 7 min。反應結束后取5.0 μL產物用于瓊脂糖凝膠電泳，其后取剩余PCR產物送至測序公司進行雙向測序。

1.4 序列分析

委托公司對返回序列進行拼接后，在基因庫內下載具有代表性不同基因型PRV毒株gE基因序列。以DNAStar軟件對本文獲得毒株及參考毒株序列進行核苷酸和氨基酸序列同源性分析；以MEGA 7.0軟件構建遺傳進化樹，分析本文獲得序列遺傳變異情況。

2 結果

2.1 河北部分地區偽狂犬病病毒感染情況調查結果

本次調查共檢測送檢樣品34批次，其中10個批次樣品豬存在PRV野毒陽性樣品，批次陽性率為29.41%；114份送檢樣品中有16份樣品檢測為PRV野毒陽性，平均陽性率為14.04%（16/114）。按照不同地區來源樣品進行統計，發現邢臺市、衡水市、石家莊市、邯鄲市和其它地區樣品PRV野毒檢出率為6.25%～22.73%，其中石家莊市檢出率最高，為22.73%（表1）。

表1 河北部分地區偽狂犬病病毒感染情況調查結果

2.2 不同季節及臨床癥狀樣品偽狂犬病病毒檢測情況

將送檢樣品按照時間和病豬臨床癥狀進行分類統計，結果如表2所示，不同季節送檢樣品PRV野毒陽性率為12.20%～16.67%，其中以秋季送檢樣品陽性率更高（16.67%），而春季和夏季陽性率差異較小，分別為12.20%和13.51%。PRV感染可導致豬群出現腹瀉、神經癥狀和流產等癥狀，進一步分類統計發現表現腹瀉、神經癥狀和流產或死胎樣品PRV野毒檢出率分別為14.29%、15.38%和8.33%。

表2 不同季節及臨床癥狀樣品偽狂犬病病毒檢測情況

2.3 部分PRV毒株基因型及遺傳變異情況分析

為初步分析河北省部分地區PRV流行毒株基因型及遺傳變異情況，采用PCR法對3份病毒載量較高（CT值＜25）樣品PRV-gE基因全長序列進行擴增、測序及分析。結果發現3份樣品gE基因序列大小均為1 740 bp，其核苷酸和對應氨基酸序列與國內2012年后流行PRV變異株對應序列同源性分別為99.4%～100.0%和99.7%～100.0%；與國內2012年前流行PRV傳統株對應序列同源性分別為98.9%～99.1%和98.4%～98.8%；與國外流行PRV毒株對應序列同源性分別為97.4%～98.6%和95.6%～97.5%。進一步系統進化樹分析結果表明，本試驗獲得的3個樣品對應毒株與國內流行變異株位于同一分支，但與國內流行PRV經典株和國外流行毒株所屬分支則相距較遠。以上結果表明，本次研究分析的3個PRV流行毒株均屬于變異株，且序列變異程度相對較低。

3 討論

根據基因序列差異，可將當前國內外流行PRV毒株分為PRV變異株（國內2012年后流行株）、傳統株（國內2012年前流行株）和國外流行株[2]，而目前存在部分免疫接種Bartha-K61疫苗的豬場仍然暴發PR疫情（由PRV變異株感染引起），這說明當前使用的疫苗對變異株保護力較差[5]。為了解當前河北省PRV流行及基因變異情況，本研究于2021年對河北邢臺及周邊地區PR疑似病料進行PRV-gE核酸檢測，并對部分樣品gE基因序列進行擴增、測序與分析。結果發現收集的114份疑似感染PR樣品中PRV野毒陽性率為14.04%，且各地區均檢測到PRV陽性樣品，說明PRV野毒在河北省廣泛流行。

由于目前豬場環境（溫度和濕度）相對恒定，且豬場持續對豬群免疫接種疫苗防控PR，使得不同季節PRV檢出率差異較小，而本研究中秋季來源樣品較夏季和春季樣品PRV檢出率稍高，這可能與送檢樣品數量和樣品來源病豬臨床表現差異等有關。進一步分析結果發現，表現腹瀉、神經癥狀和流產或死胎樣品PRV野毒檢出率分別為14.29%、15.38%和8.33%，值得注意的是此類臨床癥狀均與PR相關，但PRV檢出率依然相對較低，說明送檢樣品可能存在其它病原感染，如豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2型和豬流行性腹瀉病毒等。提示對送檢病料應進行多種病原檢測，以免造成誤診或漏診；或依靠傳統的臨床診斷已無法滿足當前疾病診斷。

進一步對3份PRV陽性樣品gE序列擴增與分析結果表明，3個毒株均屬于PRV變異株，由于當前使用的Bartha-K61缺失疫苗無法對PRV變異株感染提供完全防控，提示研究人員需診斷當前流行PRV變異株研發更加有效的疫苗，或制定相應的凈化策略，以期盡快凈化PR，減少該病對養豬業的危害。