如何保證豬場實驗室非洲豬瘟熒光PCR檢測結果的準確性

于新友，李天芝

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.渤海先進技術研究院，山東 濱州 256600）

非洲豬瘟在我國已經暴發近3年零5個月了，病毒已經形成一定的污染面。豬場毒株流行呈現多元化態勢，強毒株、天然弱毒變異株、弱毒疫苗株均有報道。一些新出現流行毒弱毒株甚至可以暫時與豬共存，與其他豬常見病發生混感。目前尚無疫苗預防，也無藥物治療，生物安全是防控非洲豬瘟的最有效方法。當前豬場主流的防非措施還是生物安全。然而所有的措施都是靠人去執行的，嚴格的措施是否能落地，要看各豬場的管理水平。

為精準防控非洲豬瘟，國家鼓勵豬場實驗室開展非洲豬瘟自檢工作，非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測為豬場實驗室常規檢測項目[1]。豬場實驗室要遠離豬場，按要求做好分區管理，每個區域固定專用移液器、槍頭、離心管、工作服等，嚴禁帶出本區域[2]。熒光PCR檢測這個非洲豬瘟發生前對大家陌生的詞匯，迅速成為熱門。很多人被逼半路出家，開展自救檢測。熒光PCR檢測是一種技術含量很高的工作，要想做好并不容易。為保證檢測結果的準確性和可靠性，筆者結合自身工作對檢測環節的一些常見問題進行總結，供豬場試驗室人員參考。

1 核酸制備方式

一些檢測單位受條件所限，選擇核酸快提試劑，關于核酸提取國家無統一明確的規定。筆者認為保證檢測結果準確，核酸提取最好采用商品化試劑盒，主要有柱式人工提取或磁珠法自動提取，各實驗室可根據自身條件和樣品數量選擇。不同廠家的試劑盒核酸提取效果肯定不一樣，價格差別也很大，要經過試驗比對篩選，盡管這樣也不能保證同廠家核酸提取試劑盒每批次的穩定性。核酸提取能對核酸富集和純化，總體效果還是好于免核酸提取法，但也不能一概而論，對組織或血清樣本應該不會影響最終結果的判定。以柱式提取法為例，科普一下怎樣從病毒到核酸。一般是200 μL樣品，經裂解、掛柱、洗滌、洗脫等幾個步驟，最終核酸50 μL。柱式法對試驗人員經驗要求高，適合少量樣本的高頻次提取操作，影響因素多。磁珠法機器操作，自動化程度高，適合大量樣本檢測，但儀器試劑成本高。核酸提取時動作輕柔，可減少氣溶膠的產生，防止樣品間交叉污染。核酸提取后，所有耗材及液體均要置于含消毒液的自封袋中，封口包裝，避免實驗室核酸氣溶膠污染。

2 檢測試劑盒的選擇

市場上非洲豬瘟熒光PCR檢測試劑盒品種繁多、魚龍混雜，價格差別大，有國產的和進口的，有合法文號的和沒有合法文號的，養殖戶選擇困難。進口試劑盒檢測結果一般較準確和可靠，但價格昂貴，不同豬場實驗室應根據自己經費情況選擇購買。國產試劑盒生產廠家較多，質量差別大，要根據國家相關政策要求，選用目前符合國家規定試劑盒開展非洲豬瘟自檢項目。鑒于些有文號試劑盒檢測效果并不理想，購買時可同業內人員溝通交流，選擇口碑好的生產廠家的試劑盒。任何檢測試劑盒都有檢測極限，敏感性和特異性不能兼得，選擇自己能把握的試劑盒。筆者曾試購買某款有文號產品3盒，敏感性確實不錯，但無論怎么做都不能保證陰性對照成立。最后查閱大量資料，將其歸結為探針時間久，降解后自發熒光。有些廠家的非洲豬瘟檢測產品都不止一款，有的多達七八種，產品質量難免參差不齊，亂象叢生。有的廠家為滿足不同的市場需求，開發不同敏感性產品。豬場實驗室也可以購買多個廠家試劑盒，用自己檢測的樣品進行驗證比對。新購買試劑盒時，試劑4 ℃融化，瞬時離心后，可根據自己檢驗量分裝保存，為保證檢測效果，試劑盡量減少凍融次數，首次檢測前最好先驗證陰性對照和陽性對照是否成立。

3 儀器和耗材的選擇

市場上儀器價格差異大，50萬的儀器和2萬的儀器檢測結果肯定不一樣，筆者做過相關研究，僅改變儀器，同一樣本檢測CT竟然相差10以上，因此，豬場實驗室在經費允許的情況下，最好購買性能優良、質量好的熒光PCR儀。為防止氣溶膠污染，熒光PCR反應加樣的槍頭應選用細長、帶濾芯的，槍頭要與移液器匹配，防止移液不準確。PCR反應8聯管可分為透明管和不透明管，0.1 mL和0.2 mL等不同類別，要與所購買的熒光PCR儀相匹配，不同批次的管和蓋不能混用。PCR反應管的蓋子一定要緊，否則一旦有陽性樣本擴增，擴增反應液揮發，會導致實驗室氣溶膠污染風險。

4 注意操作細節

柱式法核酸提取時，管體標記清晰，最后一步，延長離心時間，去除殘留酒精，防止干擾擴增反應。PCR反應加樣在生物安全柜內進行，提前紫外燈照射30 min，物品有規律擺放，合理分區，凈區在左邊，污區在右邊。廢棄槍頭打入帶蓋10% 84消毒液中，消毒液最好現用現配，最長使用時間不要超過3 d。加樣操作時配戴手套，動作輕柔，防止氣溶膠產生及模板吸入加樣器內。加樣時遵循從低濃度到高濃度的順序，先加陰性對照，再加檢測樣品，最后加陽性對照。PCR反應管蓋一定要蓋緊，避免熒光物質外漏，瞬時離心混勻，避免氣泡產生。加上后盡快上機擴增，防止探針淬滅[3]。每次試驗設置陰性對照和陽性對照，必要時增加陰性對照數量，對不同操作節段進行監控，隨機放于擴增樣品中間，陽性對照不要用強陽性樣本，尤其不要用強陽性質粒作陽性對照。PCR結束后PCR產物嚴禁開蓋，以防氣溶膠污染[4]。檢測過程中用到的吸頭、離心管、PCR反應管及時清理，嚴禁高壓滅菌，可放置于10% 84消毒液瓶中，在遠離實驗室的地方棄掉。樣品處理過程中用過的廢棄槍頭、離心管等潛在被污染物品，要高壓處理，以防實驗室人為散毒。試驗結束后對實驗室內所有地面及墻面等進行消毒，75%酒精空中噴霧，開啟紫外燈照射4 h以上。

5 弱陽性樣本檢測問題

檢測時經常碰到一些弱陽性樣本在對照成立的情況下，檢測結果時陰時陽的問題，嚴重困擾檢測人員。出現這種現象的原因眾多，首先病毒核酸含量低，存在一個取樣概率問題即所謂的撈現象，核酸如水里的湯圓不是每次都取到，目前主流試劑盒最多核酸加入量不過5 μL。試劑盒研發敏感性判定標準為稀釋至一定濃度樣本重復檢測20次，有19次檢測陽性即為最低檢測線，在其他所有條件都相同的條件下，低濃度樣本時陰時陽結果就可以理解了，但也不能排除實驗室氣溶膠污染。新冠檢測標準要求設置3份陰性對照，意思是可能存在1份陰性對照不成立的情況。建議非洲豬瘟實驗室檢測時也可以設置3份陰性對照。對于一些專家提到的非洲豬瘟熒光PCR檢測50個循環，起跳即陽的說法筆者不認同。某些引物探針擴增后期有非特異性擴增現象，市面上尚無50個循環擴增程序的廠家，包括新冠熒光PCR檢測試劑，原因值得思考。如果按此理論設定100個循環敏感性豈不更好，實際上每種試劑都有一定的擴增能力。

6 小結

鑒于診斷制品的特殊性，很難制定統一的檢測標準及結果判定方法，試劑的穩定性受到保存運輸等方面影響很難保證檢測結果始終一致。試劑盒體系不一樣、程序不一樣、使用儀器不一樣，會得到不一樣的檢測結果。此外，人員也是關鍵的，需要具備一定的專業素質，要有一定的理論知識，定期培訓和考核，持證上崗[5]，專業的人干專業的事，否則出現問題根本不知道如何分析解決，只會機械式操作。實驗室環境條件，是否有分區操作，這些所有的因素都會影響檢測結果的準確性。