一例豬藍耳病、偽狂犬病、豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病混合感染的診治

張垚垚，李 國，陸 闊，王嘉珍，程家園，陳萬杰，李 郁

（安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036）

豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種損害豬只繁殖系統以及呼吸系統的病毒性免疫抑制性傳染病。妊娠母豬感染PRRSV后會出現流產現象，產死胎和木乃伊胎，保育豬感染后則表現出生長發育性能大幅降低[1]。豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一種急性傳染病，其臨床表現為妊娠母豬流產，產木乃伊胎、死胎或弱仔，初生仔豬和保育豬嘔吐、腹瀉、震顫、咳嗽及神經癥狀[2]。豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（Streptococcus suis, SS）感染引起的人畜共患病，根據莢膜多糖抗原特性的不同，SS可分為35種血清型，即1～34型和1/2型[3]。該病可導致腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內膜炎和關節炎，給養豬業帶來重大經濟損失。副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起的豬的一種傳染病。臨床上常出現關節炎、腦膜炎和漿膜炎等癥狀，其對保育階段的豬只造成的威脅最大，常與其他病毒或細菌以混合感染的形式存在[4]。近年來，隨著養殖規模的擴大、養殖密度的增加、動物與動物產品的頻繁調運，種用動物的引進以及飼養管理不當等眾多因素，使動物疫情發生日益頻繁，多種病原混合感染現象較為常見，給養殖業造成巨大的威脅。文章以一例保育豬PRRSV、PRV、SS和HPS混合感染為例，對其進行總結報告，旨在為該類病原混合感染的防控提供借鑒。

1 發病情況和臨床癥狀

某省一規模化肥育場現存16 000頭保育豬。2021年9月中下旬該豬場部分60日齡保育豬自斷奶后陸續發病，發病率約為10%，死亡率50%，病豬臨床表現為消瘦、腹式呼吸、神經癥狀及急性死亡等癥狀。該豬場豬群均未進行疫苗免疫；對發病保育豬使用磺胺甲氧嘧啶、氟苯尼考、頭孢噻呋及阿莫西林治療均無明顯效果。

2 樣品詳情和病理變化

該豬場于2021年9月28日送檢7份保育豬病料組織（均為肺臟、肝臟、脾臟）至安徽農業大學動物傳染病研究室進行檢測，自編號為1—7，均取自60日齡保育豬。肺臟均有出血、淤血；肝臟均質脆、淤血，呈黑紫色；脾臟均質脆、淤血，呈黑紫色。

3 實驗室檢測

3.1 細菌和病毒核酸檢測

將1—7號病料組織分別混樣后進行研磨，取其上清液，分別用OMEGA微量DNA提取試劑盒和天隆科技病毒DNA/RNA提取試劑盒提取上清液中核酸作為模板。通過PCR方法檢測6種細菌核酸和2種病毒核酸，包括SS、HPS、豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）、多殺性巴氏桿菌（Pm）、豬丹毒絲菌（ER）、沙門氏菌（Salmonella）、PRV、豬圓環病毒2型（PCV2）。所用引物見表1，由通用生物（安徽）股份有限公司合成。通過實時熒光定量RT-PCR方法檢測3種病毒核酸，即PRRSV、豬瘟病毒（CSFV）和非洲豬瘟病毒（ASFV）核酸。按照世紀元亨PRRSV、CSFV和ASFV通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒說明書操作。

表1 SS、HPS、APP、Pm、ER、Salmonella、PRV、PCV2鑒定引物序列

檢測結果見圖1。1號病豬SS、PRRSV和PRV核酸檢測陽性，2號病豬PRRSV和PRV核酸檢測陽性，3號病豬PRRSV核酸檢測陽性，4號病豬為SS核酸檢測陽性，5號病豬PRRSV核酸檢測陽性，7號病豬SS、HPS、PRRSV和PRV核酸檢測陽性，其余病原核酸檢測均為陰性。通過世紀元亨PRRSV分型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒對PRRSV進行毒株類型檢測，結果顯示，PRRSV是非美洲型經典毒株、高致病性變異毒株和類NADC-30毒株的美洲型毒株。

圖1 病原檢測結果

3.2 細菌分離培養及鑒定

3.2.1 細菌分離培養與形態學觀察 無菌采集7頭病豬的病料深層組織，分別劃線接種于含5%小牛血清和1.5%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養基，采用需氧培養方式，置37 ℃條件下培養18～24 h，觀察細菌的生長情況，并挑取單個可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態特征。結果顯示，在TSA培養基（含5%小牛血清和1.5% NAD）上存在兩種不同形態的菌落：一種菌落呈灰白色半透明、表面光滑、邊緣整齊針尖狀，鏡檢為革蘭氏陽性菌，顯微鏡下呈球形或卵圓形，鏈狀排列；另一種菌落呈無色透明、光滑濕潤、針尖狀，鏡檢為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下呈球狀、短桿狀或長絲狀。

3.2.2 分離菌PCR鑒定 利用煮沸法提取分離菌基因組DNA作為模板，通過PCR方法對分離菌進行鑒定，引物同表1。結果顯示，自1號病豬肺臟和肝臟各分離出1株SS，4號病豬肺臟和脾臟各分離出1株SS，7病號豬肺臟分離出1豬SS和1株HPS，共計5株SS和1株HPS。見圖2、圖3。

圖2 SS分離菌PCR鑒定結果

圖3 HPS分離菌PCR鑒定結果

3.2.3 SS和HPS分離菌血清型鑒定 根據文獻[5-6]，利用PCR方法對分離的5株SS和1株HPS進行血清型鑒定。結果顯示，1號病豬肺臟和肝臟分離的2株SS均為血清5型（720 bp），4號病豬肺臟分離的1株SS為血清9型（368 bp），脾臟分離的1株SS為血清29型（278 bp），7號病豬肺臟分離的1株SS為血清21型（160 bp），1株HPS為血清4型（320 bp）。見圖4、圖5。

圖4 SS血清型PCR鑒定結果

圖5 HPS血清型PCR鑒定結果

3.3 藥物敏感性試驗

利用紙片瓊脂擴散法（K-B法）進行藥敏試驗，挑取5株SS和1株HPS分離菌的純培養物接種于TSB（含5%小牛血清和1.5% NAD）中培養18～24 h，校正菌液濃度至0.5麥氏比濁，在TSA培養基（含5%小牛血清和1.5% NAD）表面均勻涂布，室溫干燥5 min后，選擇18種藥敏紙片貼于瓊脂表面，置37 ℃條件下培養18～24 h后觀察結果。根據美國臨床試驗室標準委員會（CLSI/NCCLS）2016執行標準判定結果。

結果顯示，5株SS分離株均對頭孢唑林、阿莫西林敏感；均對復方新諾明、四環素耐藥；對青霉素、慶大霉素、氧氟沙星等抗菌藥物表現不同程度的耐藥。1株HPS分離株對卡那霉素、氧氟沙星、青霉素等抗菌藥物敏感；對鏈霉素、恩諾沙星、環丙沙星中度敏感；對氟苯尼考、復方新諾明、頭孢唑林等抗菌藥物耐藥。見表2、表3。

表2 5株SS分離株藥敏試驗結果

表3 1株HPS分離株藥敏試驗結果

4 診斷

根據流行病學調查、病豬臨床癥狀、病理變化以及實驗室檢查結果，判定該豬場發病保育豬主要感染PRRSV（非美洲型經典毒株、高致病性變異毒株和類NADC-30毒株的美洲型毒株），同時混合感染PRV、SS和HPS。

5 討論

近年來，養豬業發展模式由散養向集約化、規模化快速轉變，加上豬病錯綜復雜，使豬場疾病的混合感染呈現升高趨勢，給豬病的診斷和防治帶來了一定的難度。在本病例中，病原核酸檢測結果顯示，PRRSV（美洲型毒株）陽性率為71.4%（5/7），而PRV和SS陽性率為42.9%（3/7），HPS陽性率為14.3%（1/7），提示PRRSV（美洲型毒株）是引起該豬群發病的主要病原。PRRSV屬于免疫抑制性病原，豬只感染后會導致肺部巨噬細胞大量裂解，使巨噬細胞數量急劇減少，進而致使機體對其他細菌或病毒病原的免疫抵抗力下降[7]，極易繼發PCV2、PRV、SS、HPS、APP、Pm等常見病原。PRRSV分為歐洲型和美洲型兩種血清型，在我國均有相關報道[8-9]，而主要流行的是美洲型毒株，如廣西地區檢出率為25.6%（45/176）[10]，天津地區檢出率為26.3%（104/396）[11]，安徽地區檢出率為53.6%（223/416）[12]，北京、遼寧和湖南地區檢出率為44.0%（88/200）[13]。

豬藍耳病和豬偽狂犬病均為免疫抑制性傳染病，其引發的免疫抑制常導致其他多種病毒或細菌的混合感染，且尚無特效治療藥，因此疫苗免疫接種變得尤為重要。然而，該豬場保育豬均未進行任何疫苗免疫接種，加上60日齡的保育豬基本不再攜帶母源抗體，這就大幅增加PRRSV和PRV感染的幾率。目前疫苗接種是防控豬藍耳病和豬偽狂犬病的有效途徑。我國主要以經典Bartha-K61株gE基因缺失疫苗來預防豬偽狂犬病，而針對豬藍耳病主要有兩種疫苗，即滅活疫苗和弱毒活疫苗。

本病例中，利用PCR方法對分離菌及血清型進行鑒定。從7頭病豬分離到1株HPS和5株SS，其中1株HPS為血清4型，為我國主要流行血清型之一[14-17]；5株SS有4種血清型，分別為血清5、9、21和29型，表明該場SS血清型呈現復雜多樣的特點，給防治細菌性疾病帶來較大的困難。SS、HPS為條件致病菌，與PRRSV、PRV等免疫抑制性病原混合感染時，更容易造成豬群死亡率升高，這可能是該豬場死亡率高的重要原因。抗生素療法對細菌性疾病的治療具有不可替代的作用，但抗生素的不合理使用或濫用導致細菌耐藥性的產生，使得一些菌株對抗生素表現出不同水平的抗性。因此，在對病豬治療前，通過藥物敏感性試驗篩選敏感藥物，不僅能有效降低發病率和死亡率，而且在一定程度上減少細菌耐藥性的產生。本病例中5株SS和1株HPS對阿莫西林、頭孢唑林、青霉素等β－內酰胺類抗生素敏感，這與國內有關報道[18-19]基本一致，但該豬場曾使用阿莫西林等藥物，無明顯治療效果，豬群仍持續發病并死亡，提示SS和HPS并非原發性病原。根據藥敏試驗結果，可了解該豬場細菌耐藥性情況，為進一步合理用藥提供依據，有利于細菌性疾病的治療和防控計劃的制定。

根據流行病學調查、病豬臨床癥狀、病理變化以及實驗室檢查結果，判定該豬場存在PRRSV、PRV、SS、HPS多病原混合感染情況。為最大化降低養殖戶經濟損失，應積極采取綜合防制措施，如加強飼養管理、藥物防治、預防接種等，從而有效避免或減少疫病的傳播和暴發。