實驗室條件下探究二氯異氰尿酸鈉對偽狂犬病病毒的殺滅效果

黃 忍，陳 明，成 靜，向 磊，劉小兵，梁煥斌，肖 馳

（1.廣東天農食品集團股份有限公司，廣東 清遠 511500；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

消毒是豬場重要的生物安全措施之一。豬場常用的消毒方法有物理消毒法、化學消毒法和生物消毒法等，其中化學消毒法最為常用[1]。化學消毒劑的正確選擇和使用是決定豬場消毒效果的關鍵，同時化學消毒劑的價格也直接影響到豬場的消毒頻次。自2018年8月非洲豬瘟暴發以來，非洲豬瘟（African swine fever, ASF）給國內養豬業造成了巨大的經濟損失[2]。現階段還未研發出安全有效的疫苗和特效藥，生物安全是現階段防控非洲豬瘟最有效的手段[3]。消毒作為生物安全的重要環節，起到切斷傳播途徑、消滅非洲豬瘟病毒的關鍵作用[4]。然而市場上的消毒藥琳瑯滿目，其最終的消毒效果是否能達到要求，使用多大的劑量才能真正達到殺滅病毒效果是各大養殖戶和企業比較困惑的事情。現階段對于非洲豬瘟病毒的研究僅限于幾個科研機構。因此為了了解消毒藥對非洲豬瘟的殺滅效果，很多集團實驗室衍生出了很多評估方法，如通過細菌試驗和使用其他DNA病毒代替非洲豬瘟進行消毒評估試驗等[4]，也能間接說明消毒藥對非洲豬瘟的殺滅效果。鑒于此，本研究使用同類DNA病毒的偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）替代非洲豬瘟病毒進行消毒藥的評估，以期篩選出有效的消毒劑。同時我們也對二氯異氰尿酸鈉在多種條件下的殺毒效果進行評估，為幫助尋找消毒效果好且廉價的消毒藥提供選擇參考。

1 試驗時間與地點

試驗于2021年8月20日至10月28日在夾江天農食品有限公司實驗室進行。

2 材料

2.1 毒株

偽狂犬病活疫苗Bartha-K61毒株，購自某生物制藥有限公司。

2.2 試劑

過硫酸氫鉀復合鹽、二氯異氰尿酸鈉（45%，以有效率計）、氯化鈉，市購。

2.3 中和劑

根據參考文獻[5]選用4%硫代硫酸鈉生理鹽水。

3 方法

3.1 過硫酸氫鉀復合鹽溶液、二氯異氰尿酸鈉溶液對PRV核酸破壞能力的測定

使用生理鹽水對偽狂犬病活疫苗進行稀釋，同時配置1∶100、1∶200的過硫酸氫鉀復合鹽溶液和0.3%的二氯異氰尿酸鈉溶液。在常溫下分別將上述800 μL消毒液和100 μL稀釋后的疫苗液渦旋混勻相互作用30 min、5 min；每個消毒劑濃度設置4個重復，后加入100 μL中和劑終止反應；提取病毒核酸，使用PCR進行PRV檢測。對照組為800 μL生理鹽水+100 μL偽狂犬病疫苗稀釋液+100 μL中和劑。

3.2 不同濃度二氯異氰尿酸鈉對PRV核酸破壞能力的測定

將二氯異氰尿酸鈉配置成終濃度為0.08%、0.1%、0.3%、0.5%的溶液；分別取上述消毒液800 μL和100 μL稀釋后的偽狂犬病疫苗在冷藏（8～10 ℃）條件下作用30 min、10 min、1 min，每個消毒劑設置4個重復，作用時間結束后立即加入100 μL中和劑終止反應。提取核酸，使用PCR進行PRV檢測。對照組為800 μL生理鹽水+100 μL病毒液+100 μL中和劑。

3.3 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在低溫環境和無有機物條件下對PRV核酸的破壞效果

將二氯異氰尿酸鈉配置成終濃度為含10%氯化鈉的0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液。將配置好的消毒液提前放置于低溫（-8～-9 ℃）冰柜中30 min預冷；同時將稀釋好的偽狂犬病疫苗和終止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min預冷。取出各預冷樣品，將800 μL消毒液和100 μL疫苗液混合均勻后，放置在低溫（-8～-9 ℃）冰柜中作用20 min、10 min、5 min、1 min，每個作用時間設置4個重復，時間一到立即加入100 μL終止液終止反應，提取病毒核酸，進行PCR檢測。

3.4 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在高有機物和低溫條件下對PRV核酸的破壞效果

3.4.1 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在有血清存在的情況下對PRV核酸的破壞效果 將配置好的含10%氯化鈉的消毒液提前放置低溫（-8～-9 ℃）冰柜中30 min預冷；同時將稀釋好的偽狂犬病疫苗、豬血清和終止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min預冷。在2 mL離心管中同時加入預冷后的600 μL消毒液、200 μL豬血清和100 μL病毒液，渦旋、震蕩、離心后在低溫（-8～-9 ℃）冰柜中分別作用20 min、10 min、5 min、1 min，每個作用時間設置4個重復，加入100 μL中和劑終止反應，提取病毒核酸，進行PCR檢測。

3.4.2 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在有新鮮糞便存在的情況下對PRV核酸的破壞效果 將配置好的含10%氯化鈉的消毒液提前放置低溫（-8～-9 ℃）冰柜中30 min預冷；將稀釋好的偽狂犬病疫苗、豬糞和終止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min預冷。在2 mL離心管中同時加入預冷后的800 μL消毒液、1 g豬糞便和100 μL病毒液，渦旋、震蕩、離心后置于低溫（-8～-9 ℃）冰柜中分別作用20 min、10 min、5 min、1 min，每個作用時間設置4個重復，加入100 μL終止液終止反應，提取病毒核酸，進行PCR檢測。

4 結果

4.1 兩種消毒藥對PRV核酸破壞效果的測定結果

從試驗結果看，在相同的條件下，終濃度為0.3%的二氯異氰尿酸鈉溶液對PRV核酸的破壞作用優于過硫酸氫鉀復合鹽溶液。結果見表1。

表1 消毒藥與病毒作用后核酸PCR結果

4.2 不同濃度二氯異氰尿酸鈉對PRV核酸破壞效果的測定結果

由表2可知，0.3%的二氯異氰尿酸鈉溶液與PRV反應后，核酸PCR結果CT值為0，且濃度越高殺滅效果越好，而低于0.3%濃度的二氯異氰尿酸鈉溶液仍能檢測到CT值。

表2 不同濃度二氯異氰尿酸鈉溶液與病毒作用后核酸PCR結果

4.3 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在無有機物環境下與PRV作用核酸PCR結果

由表3可知，0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在低溫且無有機物條件下與偽狂犬病疫苗作用1 min，可完全將病毒核酸破壞。

表3 與消毒液作用后PRV核酸PCR結果

4.4 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在高有機物條件下與PRV作用核酸PCR結果

由表4可知，0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在有20%血清和低溫（-8～-9 ℃）條件下與偽狂犬病疫苗作用20 min可完全將病毒核酸破壞。由表5可知，0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在有1 g糞便和低溫（-8～-9 ℃）條件下與偽狂犬病疫苗作用10 min可完全將病毒核酸破壞。

表4 二氯異氰尿酸鈉溶液、疫苗液和血清三者混合作用下PRV核酸PCR結果

表5 二氯異氰尿酸鈉溶液、疫苗液和糞便三者混合作用下PRV核酸PCR結果

5 討論

本試驗通過PCR檢測方法，探討了兩種消毒劑對PRV核酸的破壞作用，通過試驗最終確定了終濃度為0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液對PRV核酸的破壞作用更強；同時開展了0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在無有機物和高有機物條件下對病毒核酸破壞效果的試驗。試驗結果顯示，在無有機物條件下0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在1 min可完全破壞病毒的核酸，而在有20%血清情況下需要20 min才能完全破壞病毒核酸，在有1 g新鮮糞便情況下需要10 min就能完全破壞病毒核酸。本研究還考慮到了低溫區域存在冰凍的現象，因此也評價了消毒藥在低溫（-8～-9 ℃）條件下對偽狂犬病核酸的破壞效果。

對于消毒藥的評估有多種方法。徐振娜等[6]通過消毒液和H3N2豬流感病毒混合后感染雞胚，并通過雞胚的成活率來判定消毒液的消毒效果。肖琦等[7]將次氯酸分別和等量圓環病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬細小病毒（PPV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）混合后作用一定時間，然后感染對應細胞，通過96孔板細胞病變來判定次氯酸消毒液的消毒效果。而在大多數的養豬企業中，還沒有健全的實驗室，在細胞培養和雞胚培養等技術及相關操作上也不成熟。多數消毒藥是先作用于病毒核酸外的物質，如蛋白和各類酶，最后才作用于病毒的核酸，破壞核酸。反過來思考，一旦病毒的核酸遭到破壞，那么病毒一定是已經滅活。本研究就是根據該思路進行試驗設計。而且通過核酸來判定病毒是否滅活，對很多實驗室來說是完全能夠進行的。該方法能夠簡單、直觀地判定病毒的滅活狀態。

在養豬生產中，對于消毒劑的選擇，我們多使用過硫酸氫鉀復合鹽、濃戊二醛溶液、過氧乙酸和燒堿等。針對二氯異氰尿酸鈉溶液的使用報道相對較少，胡正華等[8]和崔玉杰等[9]探究了二氯異氰尿酸鈉溶液對水中微生物的殺滅效果，并驗證了二氯異氰尿酸鈉溶液具有較好殺菌、消毒效果。本試驗不僅驗證了二氯異氰尿酸鈉溶液和其他消毒液具有同等的殺病毒效果，還驗證了在高有機物和低溫條件下二氯異氰尿酸鈉溶液還具有較強的破壞病毒核酸效果。