棗莊黑蓋豬精液品質與睪丸組織學研究

陳 濤，朱曉東，孫厚偉，曾勇慶，陳 偉

（1.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018；2.棗莊黑蓋豬養殖有限公司，山東 棗莊 277100）

棗莊黑蓋豬是我國優良的地方豬種之一，具有性成熟和體成熟早、繁殖性能高、肉品質優良等特征，是典型的華北型豬種[1]。精液品質不僅是揭示精液受精能力的綜合指標，而且嚴重影響著豬場的盈虧和豬群的擴繁速度。提高地方豬的精液品質有利于加快地方豬的擴群和遺傳改良，以及提高受胎率。由于精子的生成受下丘腦-垂體-睪丸軸的調控，所以精子的生成離不開睪丸的發育，而睪丸生長隨年齡的增加發生相關的生理變化[2]。

近年來，隨著國家對地方豬種質資源的重視和非洲豬瘟對生豬產業的影響，地方豬的保種和開發利用迫在眉睫。本研究旨在通過對棗莊黑蓋豬精液品質與生精小管組織學進行分析，揭示棗莊黑蓋豬公豬繁殖性能的特點，為探究地方豬公種豬的遺傳改良和合理利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗時間為2020年9月至11月底。試驗地點為棗莊黑蓋豬養殖有限公司。選取棗莊黑蓋豬種公豬18頭按年齡分為3組（6頭/組），進行精液品質測定。

選取14日齡棗莊黑蓋豬公豬（HG×HG）13頭、80日齡棗莊黑蓋豬公豬（HG×HG）6頭和14日齡杜洛克公豬與棗莊黑蓋豬母豬雜交的F1代公豬（D×HG）17頭，進行保定后摘取左側睪丸，用0.9%生理鹽水清洗，然后放入組織固定液，最后置于4 ℃冰箱保存。

1.2 飼養管理

成年公豬均單欄飼養，自由飲水，半露天式圈舍，自然通風，每天飼喂兩次。生長期公豬5頭/欄，自由采食。免疫、保健和消毒水平均相同。

1.3 棗莊黑蓋豬精液品質測定

經馴化后，多數公豬可以使用假臺豬采集精液，部分公豬只能使用發情母豬作為臺豬采精，公豬馴化期間放精兩次，間隔5～7 d后進行試驗，每頭公豬采精3次，采精間隔均為3 d。在棗莊黑蓋豬養殖有限公司獸醫實驗室進行測定，每份精液于10 min內完成測定。精液采集與精液品質測定方法同王黎等[3]所用的方法。

1.4 睪丸組織石蠟切片制作與形態學觀察

睪丸組織經48 h固定后進行橫切，修成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織塊；組織塊經沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后切片；石蠟組織切片經HE染色后使用中性樹膠封片。

將睪丸組織切片在顯微鏡下用NIS-Element軟件測量生精小管內徑和界膜厚度并拍照。每個試驗組選取橫斷面近似正圓的生精小管100個，按Makler評分法對生精小管內徑、基膜厚度、管壁生殖細胞層數和生殖細胞成熟度評估，方法同韋思明[4]。

1.5 數據處理

利用SPSS Statistics 26軟件對精液品質性狀的試驗數據進行單因素方差分析和顯著性檢驗；采用GraphPad Prism 8軟件對Makler評分進行t檢驗并做圖；使用Photoshop CC 2019軟件處理圖片。所有數據以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 棗莊黑蓋豬精液品質分析

棗莊黑蓋豬精液品質中的精子密度（圖1A）、精子活力（圖1B）和精子活率（圖1C）隨著年齡的增加呈降低趨勢，這3個性狀均以1～2歲組最高，極顯著高于3～4歲組和5～6歲組。而精子畸形率以5～6歲組最高（35.83%），1～2歲組最低（10.50%），各組間呈極顯著差異（圖1D）。3～4歲組棗莊黑蓋豬的pH（圖1E）、采精量（圖1F）和采精時間（圖1G）極顯著高于1～2歲組（P＜0.01），同樣高于5～6歲組但差異不顯著（P＞0.05）。精液的溫度隨年齡的增加呈上升趨勢（圖1H）。

圖1 棗莊黑蓋豬精液品質分析

2.2 精液品質各性狀相關性分析

由表1可知，棗莊黑蓋豬的精子活力與活率呈強度正相關，而二者與畸形率分別呈強度和中度負相關（P＜0.01）；精液溫度與畸形率存在強度正相關，與活力和活率則存在中度負相關（P＜0.01）。此外，采精量與采精時間存在極強正相關，且二者均與精液pH存在強度正相關（P＜0.01）。

表1 棗莊黑蓋豬精液品質各性狀相關性

2.3 棗莊黑蓋豬睪丸組織學和Makler評分分析

將HE染色后的組織切片置于顯微鏡下觀察（40×），棗莊黑蓋豬睪丸組織中曲細精管的生殖細胞層數（圖2A）和內徑（圖2B）隨著日齡增加而增加。80日齡棗莊黑蓋豬公豬睪丸組織中生精小管內徑（圖2C）、界膜厚度（圖2D）、管壁生殖細胞層數（圖2E）、生殖細胞成熟度（圖2F）和Makler評分（圖2G）均高于14日齡棗莊黑蓋豬（P＜0.01）。

圖2 棗莊黑蓋豬睪丸組織學（40×）和Makler評分分析

2.4 棗莊黑蓋豬雜交后代睪丸組織學和生精小管Makler評分分析

將HE染色后的組織切片置于顯微鏡下觀察（20×），在相同視野下14日齡的杜洛克公豬與棗莊黑蓋豬母豬雜交的F1代公豬（圖3A）的生精小管比14日齡棗莊黑蓋豬公豬的排列更加緊密（圖3B）；而且杜洛克公豬與棗莊黑蓋豬母豬雜交的F1代公豬的生精小管內徑（圖3C）、管壁生殖細胞層數（圖3D）和Makler評分（圖3E）均顯著高于棗莊黑蓋豬（P＜0.05），但是界膜厚度和生殖細胞成熟度沒有差異。

圖3 不同父本間豬睪丸組織學（20×）和Makler評分分析

2.5 棗莊黑蓋豬曲細精管生殖細胞發育分析

為探究80日齡棗莊黑蓋豬曲細精管生殖細胞發育程度，對棗莊黑蓋豬曲細精管腔內生殖細胞進行觀察和分析，發現靠近基膜的精原細胞數量逐漸減少，多數曲細精管內形成管腔（圖4A和圖4B）；基膜至管腔間出現大量減數分裂Ⅰ期和減數分裂Ⅱ期精母細胞；延伸形態精子依附于基膜、支持細胞或游離于管腔附近，在靠近管腔處發現精子殘余體和大量圓形精子（圖4C），說明80日齡棗莊黑蓋豬已進入初情期。

圖4 棗莊黑蓋豬曲細精管生殖細胞發育分析（40×）

3 討論

3.1 年齡對棗莊黑蓋豬精液品質的影響

地方豬養殖中的配種方式多以本交為主，較少使用人工授精進行擴繁，導致種公豬利用率和擴繁效率較低。公豬精液品質一般從1歲后開始升高，在2～3歲時精液品質達到最佳，然后在4歲以后開始下降；而后備公豬最初的精液中往往含有大量死精和畸形精子，導致其精液品質較差[3]。公豬睪丸溫度升高會改變類固醇的生成，伴隨著過度的熱傳遞可能會影響精子結構完整性，導致射精量減少、精子活力下降、畸形精子數的增加[5]。精液品質雖然不會立即受到睪丸溫度變化的影響，但會在熱應激后兩周開始下降，直到熱應激結束8周后才恢復正常[6-8]。為減少熱應激對精液品質的影響，本研究選擇秋季進行試驗，結果發現隨著棗莊黑蓋豬年齡的增長，精子密度、精子活力和精子活率均呈下降趨勢，而精子畸形率和精液溫度則呈上升趨勢，說明棗莊黑蓋豬精液品質受年齡影響較為顯著；這是由于睪丸組織的生精功能發生了與年齡相關的組織學變化，導致射精量和精子活率的下降，從而影響精液品質[2]。因此，在棗莊黑蓋豬的保種工作中，應加強對年輕公豬的飼養管理以提高核心群擴繁的效率；在夏季適當添加氨基酸和維生素以提高性欲并改善精液品質[9-10]。

3.2 日齡和父本對生精小管發育的影響

睪丸的組織學和生理學變化與年齡極為相關，尤其表現在精子產生和生殖激素功能的改變。年齡對睪丸組織學的影響在人類醫學研究領域較為成熟，而對地方豬的研究有限[2，11]。本研究利用Makler評分系統評估了棗莊黑蓋豬睪丸組織學變化，發現棗莊黑蓋豬生精小管內徑和管壁生殖細胞層數隨著日齡的增加而增加。而相同日齡條件下，杜洛克公豬與棗莊黑蓋豬母豬雜交的F1代公豬除界膜厚度和生殖細胞成熟度均高于純種棗莊黑蓋豬，說明前者具有一定的雜交優勢，可能更早進入體成熟階段[12]。通過對睪丸組織切片的HE染色進行生精上皮組織形態學分析，發現純種棗莊黑蓋豬生精小管在80日齡時出現管腔，并伴有少量精子產生，同時在切片中發現各級生殖細胞；棗莊黑蓋豬與太湖豬相比，純種棗莊黑蓋豬在80日齡時生精小管直徑為141.96 mm，大于120日齡太湖豬的122.64 mm[13-14]；綜上結果表明，棗莊黑蓋豬在80日齡達到初情期并具有一定的受精能力和早熟特性。

4 結論

本研究發現，從棗莊黑蓋豬精子密度、精子活力和精子畸形率等方面綜合考慮，棗莊黑蓋育種核心群中的種公豬年齡結構應以1～2歲為主，可縮短育種群的世代間隔，加快遺傳進展。此外，研究發現棗莊黑蓋豬公豬的初情期較早，可為棗莊黑蓋豬公豬繁殖性能及初情期的確定提供參考。