迪慶藏豬ADFP基因第一外顯子多態性位點遺傳分析

相德才，張 斌，劉韶娜，吳國權

（云南省畜牧獸醫科學院/云南省種豬性能測定站/云南省種豬質量檢驗測試中心，云南 昆明 650224）

脂肪分化蛋白基因（Adipose differentiationrelated protein, ADFP）是一種在脂肪細胞中表達的蛋白，在脂肪細胞前體分化成成熟脂肪細胞時被轉錄激活[1]。ADFP基因位于豬1號染色體q2.3～q2.7區域，包含8個外顯子，全長約13 kb[2]。cDNA序列為1 848 bp，編碼459個氨基酸[3]。大量研究發現，ADFP基因的遺傳變異不僅與背膘厚度和肌內脂肪性狀的表型變異有關[4]，還可以作為豬肌內脂肪沉積和大理石紋特征的候選基因[3]。

迪慶藏豬為云南省迪慶藏族自治州特產，以肉質優良而著稱，其肌肉鮮紅，富有光澤，肉質鮮嫩，味香可口，營養豐富。本研究以迪慶藏豬為研究對象，利用測序技術對ADFP基因部分啟動子區域和外顯子1進行SNP篩選，并對SNP位點進行遺傳分析，為迪慶藏豬機體脂肪沉積和分子育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究隨機挑選124頭10月齡迪慶藏豬為試驗材料，于2020年1月在迪慶藏族自治州迪慶藏豬保種場，采集其耳組織置于裝有75%酒精的離心管中，-20℃保存。利用組織基因組DNA提取試劑盒提取耳組織基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度。

1.2 引物設計

根據GenBank提供的豬ADFP基因序列（NC_010443.5），用Primer Premier 5.0與Oligo 6.0軟件設計引物序列1對，引物序列為F：5'-TAAAGAGCAGCAAAACCGCA-3'，R：5'-CACACCAAACAGCCCTACAG-3'，擴增片段長度為926 bp，送英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.3 PCR擴增和測序

PCR擴增體系總體積為25 μL，包含Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，基因組DNA模板（約50 ng）2 μL，8.5 μL ddH2O。PCR擴增反應條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，而后送至中美泰和生物技術（北京）有限公司進行測序。

1.4 統計方法

采用GeneStar軟件對測序數據進行分析比對，并用Excel對數據進行計算。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果和測序結果

PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統成像，結果見圖1。由圖1可知，擴增產物特異性較好，片段大小約為926 bp，與預期片段大小一致。

圖1 迪慶藏豬ADFP基因目的片段PCR擴增產物

經過GeneStar軟件對測序數據進行分析，由圖2可知，迪慶藏豬在ADFP基因啟動子區域存在2個SNPs，分別為T195C和G202A；外顯子1上存在6個SNPs，分別為G225A、C227G、C279G、C386G、C396T和G504A。

圖2 ADFP基因目的片段測序結果比對

2.2 基因頻率、基因型頻率和遺傳特性分析

對各SNPs進行了基因頻率、基因型頻率、多態信息含量、純合度、雜合度計算（表1）。結果顯示，各位點在迪慶藏豬豬群中均處于Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。群體遺傳分析顯示，本研究發現的SNPs多態信息含量處于低度多態，C396T位點最高為0.188 9，T195C、G202A和G225A位點最低，均為0.038 4；雜合度均小于0.5，C396T位點最高為0.211 2，T195C、G202A和G225A位點最低，均為0.039 2。

表1 不同SNPs位點基因頻率、基因型頻率、多態信息含量、純合度、雜合度

由表2可知，SNP4與SNP5之間D'值接近0，說明兩位點間連鎖平衡的可能性很小，其余大部分SNP位點之間D'值接近1，說明這些位點間發生重組的可能性很小；而D'值接近中間值的則無法比較兩位點連鎖平衡的差別。

表2 各SNPs之間連鎖分析（D'值）

單倍型分析結果表3，常見單倍型有6種，累計頻率為0.972 1，其中單倍型1的頻率為0.724 2，單倍型2的頻率為0.069 2，單倍型3的頻率為0.053 4。

表3 8個SNPs組成的單體型分析結果

3 討論

顧麗菊等[5]在兩個地方豬種ADFP基因中篩查到5個SNPs，分別為T37C、T140C、G777A、A1061G和A1117G。本研究共在ADFP基因啟動子區域和外顯子1上發現8個SNPs，其中G225A位點引起了氨基酸突變；甘氨酸突變為絲氨酸，C386G位點引起了氨基酸突變，谷氨酰胺突變為谷氨酸；其余位點為無義突變。

ADFP基因可作為研究脂肪沉積的候選基因，主要參與脂肪細胞的生成、轉移、代謝和儲存等過程，對調節機體的脂肪沉積過程有著相當重要的作用[6]。經過Hardy-Weinberg平衡檢驗，各SNPs均處于平衡，說明人工選擇壓較小，有利于發展下一步的遺傳育種工作。本研究發現所有的SNPs多態信息含量（PIC）和雜合度（He）均小于0.5，說明群體內基因型遺傳變異較小，選擇潛力也比較小，為下一步研究ADFP基因SNPs的基因型對脂肪沉積的調控提供重要依據，也為下一步開展遺傳育種工作提供了理論基礎。