新型負壓過濾系統的過濾效果和殺菌性能

孫萬啟（通信作者），李劍，李楓，趙巖峰，張春華，王芳，馬挺軍

1 山東中昊控股集團有限公司 （山東德州 253000）； 2 北京農學院 （北京 102206）

近年來，SARS 病毒、A/H1N1病毒、埃博拉病毒及新型冠狀病毒等病毒的傳播已奪取了成百上千萬人的生命，引起了世界范圍內的恐慌，急需對該類微生物進行有效防護。負壓過濾系統是控制傳染病源以及負壓隔離所必需的核心設備，其主要作用原理是通過使封閉空間內的壓力保持負壓來阻止受污染空氣的外泄。傳統的負壓設備只能對細菌、病毒起到攔截作用，不進行消殺，導致攔截在過濾介質中的微生物可能會快速繁殖，從而對隔離的空間產生嚴重的二次污染[1-4]。因此，十分必要在負壓過濾系統中引入殺菌裝置，實現對攔截微生物的原位消殺。

傳統的殺菌方法包括高溫加熱法、強射線照射法及化學氧化法等，但具有操作溫度高、耗費時間長或有腐蝕性等缺點[5]。隨著科學技術的不斷發展，低溫等離子體殺菌技術開始被應用于殺菌操作中[6-7]，其具有操作溫度低、耗時極短、無需通風及不會傷害操作人員等優點[8-11]，是一種理想的殺菌技術。目前，市售的很多空氣消毒器已經采用了此項技術，但其在負壓過濾系統中的應用還未見報道?；诖耍狙芯繉σ环N采用低溫等離子體技術實現原位殺菌的新型負壓過濾系統（自研）的過濾效率進行了評價，并考察了其殺菌效果，進一步分析了殺菌機理，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新型負壓過濾系統（自研）：新型負壓過濾系統主要由殼體、濾芯、風機、低溫等離子體發生器等組成，見圖1。殼體一端（進氣口）連接醫療艙室排風管道的出風口，另一端連接軸流風機，殼體內部設有濾芯（濾芯采用改性混合纖維材質），濾芯頂端與進風口之間安裝有低溫等離子體發生器。其工作過程為：氣流由進氣口進入，首先與低溫等離子體發生器產生的活性物質（高能電子、氧自由基、正離子等）混合，混合后的氣流依次通過濾芯和風機后排放至大氣中。在此過程中，流經低溫等離子體發生器的微生物會被活性物質消殺，截留在濾芯上的細菌和病毒也會被消殺。

圖1 新型負壓過濾系統的結構

儀器：風量罩（沈陽加野科學儀器有限公司，型號GTI610型）、激光散射法氣溶膠數濃度譜和質量濃度監測儀（德國GRIMM 氣溶膠科技公司，型號Grimm180型）、U 型壓力計（常州盛之源儀器儀表有限公司，型號BYYUU 型）、氣溶膠發生器（自制）、細菌培養基（自制）、掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社，型號JSM-6700f 型）、便攜式pH/ORP/電導率計（上海尚闊儀器技術有限公司，型號HQ30d 型）。

試驗菌株：大腸桿菌（ATCC 25922）、枯草芽孢桿菌（ATCC 9372）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538），均購自中科院微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 過濾效率和阻力值的測量

采用國標方法對過濾效率和阻力值進行檢測，具體方法見GB/T 6165-2008《高效空氣過濾器性能試驗方法效率和阻力》。

1.2.2 菌懸液的制備

在無菌操作條件下打開凍干菌種管（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌），使用無菌吸管吸取0.4 ml的液體培養基，滴入菌種管內，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解成懸浮狀液體；使用高壓滅菌后的移液槍頭吸取液體，接種于液體培養基中，接種量為2%～5%；混勻后在37 ℃、180 r/min恒溫恒濕搖床中活化12 h得到一代菌懸液；使用無菌接種環在LB固體培養基中劃線，封口，經37 ℃恒溫培養箱培養12 h后挑選3～4個大腸桿菌單菌落接種于6 ml液體培養基，封口，在37 ℃、180 r/min恒溫恒濕搖床中活化12 h得到二代菌懸液，此時菌活性較強，滿足試驗需求。其中，一代菌懸液劃線培養出單菌落的固體培養基可用封口膜密封后放置在4 ℃冰箱中保存使用2周。

1.2.3 殺菌試驗

將菌種放入新型負壓過濾系統內腔，對菌液進行不同時間的處理；在溫度為20～25 ℃、相對濕度為50%～70%的條件下，開啟該系統，運行不同時間分別進行處理，作為試驗組，不進行消毒的一組作為空白對照組；處理完成后，將采樣平板置于37 ℃培養箱內培養48 h，觀察結果并計算存活率，用以反映殺菌效果；每組試驗至少重復3次。

1.3 評價指標

1.3.1 過濾效率

過濾效率以η過慮計，數值以百分數（%）表示，按公式（1）計算：

式中，η過慮為過濾效率的數值，單位為%；C前為設備前氣溶膠濃度值，單位為個；C后為設備后氣溶膠濃度值，單位為個。

1.3.2 存活率

存活效率以η存活計，數值以百分數（%）表示，按公式（2）計算：

2 結果

2.1 過濾效率的測試結果

本研究對新型負壓過濾系統的流量、阻力損失與去除效率的關系進行了考察，利用氣溶膠發生器產生定量濃度的氣溶膠氣流，氣流通過新型負壓過濾系統，采用激光散射法氣溶膠數濃度譜和質量濃度監測儀測量其前、后氣流中的氣溶膠濃度，以U 型壓力計測試氣流通過時的壓力損失，以風量罩測量氣流的流量，測試結果見圖2。結果顯示，隨流量的增加，阻力損失逐步增大；當流量在200～500 m3/h 范圍內變化時，設備去除效率基本穩定在99.9985%，當流量從500 m3/h增至900 m3/h時，設備去除效率從99.9985%降至99.9965%。

圖2 流量、阻力損失與去除效率的關系

2.2 不同放電功率的滅菌效果

在溫度為20～22 ℃、相對濕度為50%～55%的條件下，新型負壓過濾系統中低溫等離子體發生器放電時間5 min時，細菌存活率（采用自制細菌培養基來培養細菌）與放電功率的關系見圖3。結果顯示，分別采用低、中、高3種放電功率處理時，大腸桿菌的存活率依次為90%、10%和0%，金黃色葡萄球菌的存活率依次為95%、30%和0%，枯草芽孢桿菌的存活率則依次為98%、55%和15%，表明在作用時間相同的條件下，隨放電功率的升高，細菌存活率逐漸降低。

圖3 不同放電功率作用后的細菌存活率

2.3 不同種類細菌隨處理時間的滅菌效果

在溫度為20～22 ℃、相對濕度為50%～55%的條件下，開啟新型負壓過濾系統，使用低放電功率處理大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，其存活率見表1。由表可知，隨處理時間的增加，細菌存活率明顯降低，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌分別在20、30和60 min時被完全殺滅；新型負壓過濾系統在相同條件下殺滅3種菌種的難易程度為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。

表1 不同處理時間的細菌存活率

2.4 處理不同時間大腸桿菌蛋白泄漏量及電導率的變化

不同處理時間（低放電功率條件下）大腸桿菌蛋白泄漏量和電導率（使用便攜式pH/ORP/電導率計測量）的變化曲線見圖4。大腸桿菌的蛋白泄漏量隨放電時間的延長而增多，30 min 內從0增加到111.9 μl/ml；大腸桿菌菌液的電導率也隨放電時間的延長而增大，30 min 內由450 μS/cm 增加到702 μS/cm，增加了56%。

圖4 處理不同時間大腸桿菌蛋白泄漏量及電導率的變化

2.5 表面形貌

掃描電子顯微鏡是一種介于透射電子顯微鏡和光學顯微鏡之間的顯微設備，其利用聚焦、很窄的高能電子束來掃描樣品，通過光束與物質間的相互作用，激發各種物理信息，并通過信息收集、放大、再成像以達到表征物質微觀形貌的目的。

新型負壓過濾系統放電處理前、后大腸桿菌的掃描電鏡照片見圖5。由圖可知，處理前，大腸桿菌的細胞壁和細胞膜結構完整，電子密度高，而處理后細胞壁變得粗糙，電子密度降低，且部分菌體發生核心溶解，菌體近乎空殼。

圖5 新型負壓過濾系統處理前、后大腸桿菌的掃描電鏡照片

新型負壓過濾系統放電處理前、后枯草芽孢桿菌的掃描電鏡照片見圖6。由圖可知，未放電處理芽孢的胞壁完整，胞質均勻；放電處理后，芽孢外壁已破損，流出膠狀物質，體積縮小且外層結構有凹陷，表明該殺菌技術可有效殺死芽孢。

圖6 新型負壓過濾系統處理前、后枯草芽孢桿菌的掃描電鏡照片

3 討論

3.1 過濾效果評價

過濾效率是評價負壓過濾系統工作效能的基本指標，其與設備本身過濾材料的孔隙率、氣體流量、氣溶膠粒徑的大小及含量等相關。從圖2的試驗結果看，當流量在200～500 m3/h 范圍內變化時，設備去除效率基本穩定在99.9985%，此性能達到了超高效空氣過濾器的指標要求[12]，當流量從500 m3/h 增至900 m3/h 時，設備去除效率從99.9985%降至99.9965%，但其性能仍高于WS/T 292-2008《救護車》[13]對氣溶膠過濾效率（達到99.7%）的要求。

3.2 殺菌效果評價與殺菌機理探討

細菌存活率在此用于評價該新型負壓過濾系統對生物氣溶膠的殺滅性能（細菌存活率越低，表明設備的殺菌效果越好）。該設備使用低溫等離子體殺菌技術，其殺菌性能與低溫等離子體發生器自身的放電功率、微生物種類、作用時長等有關。圖3結果顯示，當處理時間相同時，放電功率越高，殺菌效果越好。其原因在于，高放電功率有助于氣體放電產生更多的高能電子、氧自由基和正離子等活性粒子，氧自由基越多，越容易與細菌體內蛋白質和核酸分子發生反應，從而致其死亡；同時，足夠多的正離子會穿透細菌的細胞壁，破壞細胞膜，導致其死亡[14]。表1結果顯示，隨處理時間延長，3種細菌均逐漸被殺滅，但不同種類細菌被殺滅所需要的時間不同。革蘭陰性菌細胞壁的厚度約為2 nm，革蘭陽性菌細胞壁的厚度為15～18 nm，所以，屬于革蘭陰性菌的大腸桿菌因細胞壁薄而比屬于革蘭陽性菌的金黃色葡萄球菌更容易被殺滅[15]，枯草芽孢桿菌最難被殺死的原因在于其抗性較強，芽孢對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和多種有毒的化學物質均有很強的抗性[16]。

考察菌體蛋白泄漏量、電導率隨放電處理時間的變化可以間接反映菌體受破壞的程度變化，對放電前、后的菌體進行掃描電鏡照相可以直接觀察菌體被破壞的樣貌變化，以上結果可為放電處理過程中殺菌機理的探索提供參考。由圖4可知，大腸桿菌的蛋白泄漏量隨放電時間的延長而增多，由此反映出負壓過濾系統的放電處理與細胞膜之間的作用效果隨放電時間的延長而逐漸增強，原細胞的完整性在一定程度上遭到破壞，致使胞內蛋白類物質持續外泄[17]。同樣原理，經放電處理后，大腸桿菌細胞內的其他內容物也會不斷析出，導致胞外菌液的電導率隨之不斷增大[18]。圖5和圖6顯示的是大腸桿菌和枯草芽孢桿菌放電前、后的掃描電鏡結果。放電處理后，大腸桿菌的細胞壁變得粗糙，電子密度降低，分析其原因，一方面，可能是細胞壁和細胞膜被氧自由基等活性粒子破壞，細胞內容物漏出，另一方面，可能是由活性粒子進入菌體細胞與其內部的大分子物質（蛋白質、核酸等）反應所致[19]。放電處理后，枯草芽孢桿菌發生了破損，其發生機理與細胞壁變粗糙的機理類似，一方面，可能是放電產生的高能粒子穿透了細胞壁并釋放能量破壞了芽孢結構，從而造成細胞內容物溢出所導致[20]，另一方面，可能是產生的氧自由基等同芽孢內的蛋白質、核酸發生反應導致其變性凝固，進而使芽孢體積縮小，最終死亡所導致[21-22]。

綜上所述，該新型負壓過濾系統過濾性能良好，具有較高的原位殺菌效率，在傳染病防治領域有很好的應用前景，亦可用于冷庫、空調風道、人防設施、生物安全實驗室等空間內微生物的過濾和消殺。