竹節香附素A通過PI3K/Akt/mTOR信號通路對人宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響

張娟 李雪 蔣浩 黃曉萍

【摘要】目的 觀察竹節香附素A（RDA）對人宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用機制。方法 分別使用0、5、10、20及40μmol/L的RDA干預HeLa細胞48 h，CCK-8實驗測定細胞增殖率，計算半抑制濃度（IC50），確定藥物濃度。流式細胞術檢測細胞凋亡，蛋白免疫印跡法檢測細胞中B細胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相關x蛋白（Bax）、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的蛋白表達水平。將HeLa細胞分為4組，即空白對照組、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）組、RDA組和聯合用藥組，檢測及比較各組細胞增殖率、凋亡率和p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達量。結果 隨著RDA濃度的增加，HeLa細胞的增殖率降低、凋亡率升高（P均< 0.05），Bax、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量升高（P均< 0.05），Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量降低（P均< 0.05）;IGF-1激活PI3K/Akt/mTOR信號通路后，RDA仍然能抑制HeLa細胞增殖（P均< 0.05），降低p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量（P均< 0.05）。結論 RDA可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對人宮頸癌HeLa細胞產生抑制增殖與促進凋亡的效果。

【關鍵詞】竹節香附素A;HeLa細胞;宮頸癌;細胞凋亡;PI3K/Akt/mTOR信號通路

【Abstract】Objective To investigate the effect of Raddeanin A （RDA） on the proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells and to explore the possible mechanism. Methods HeLa cells were cultured in vitro and treated with RDA at a concentration of 0， 5， 10， 20， and 40 μmol/L for 48 h. Cell proliferation rate was determined by CCK-8. The half-maximal inhibitory concentration （IC50） was calculated to determine the drug concentration. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis， and western blot was employed to detect the expression levels of Bcl-2， Bax， Cleaved-caspase-3， p-PI3K， p-Akt， and p-mTOR proteins. Hela cells were divided into four groups： control group， IGF-1 group， RDA group and combined treatment group. The proliferation rate， apoptosis rate， relative expression levels of p-PI3K， p-Akt and p-mTOR proteins were detected and compared among different groups. Results The proliferation rate of HeLa cells was significantly declined， whereas the apoptosis rate was significantly elevated with the increasing concentration of RDA （both P < 0.05）， the relative expression levels of Bax and Cleaved-caspase-3 proteins were significantly up-regulated （both P < 0.05）， whereas those of Bcl-2， p-PI3K， p-Akt and p-mTOR proteins were significantly down-regulated （all P < 0.05）. After the activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by IGF-1， RDA could still inhibit the proliferation of HeLa cells and down-regulate the relative expression levels of p-PI3K， p-Akt and p-mTOR proteins （all P < 0.05）. Conclusion RDA can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of cervical cancer HeLa cells by suppressing the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

【Key words】Raddeanin A; HeLa cell; Cervical cancer; Apoptosis; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

宮頸癌在全球女性常見惡性腫瘤中居第四位，在發展中國家常見惡性腫瘤中居第二位[1]。當前的治療策略包括手術切除、化學治療和放射治療，但療效均有限[2]。如何預防與治療宮頸癌是全球醫學工作者們共同關注的課題。竹節香附素A（RDA）是從常用的傳統中草藥海葵中提取的一種活躍三萜皂苷，通過抑制腫瘤細胞增殖和血管生成產生抗腫瘤活性，同時能誘導多種腫瘤細胞凋亡，如大腸癌細胞、胃癌細胞和肝癌細胞[3]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/ 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號通路是一條常見的細胞信號通路，由于mTOR能調節細胞代謝活動，因此被作為抑制腫瘤細胞生長的靶點。有研究者發現，RDA可能通過激活p38MAPK通路和抑制mTOR活化誘導胃癌細胞凋亡[4]。RDA在宮頸癌中未有相關報道。因此，本研究探究RDA對人宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其可能的作用機制。

材料與方法

一、主要材料

人宮頸癌HeLa細胞，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。RDA，純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司，批號20190203;胰島素樣生長因子-1（IGF-1），純度≥98%，貨號PHG0078，購自美國Gibco公司。

二、主要試劑和儀器

高糖DMEM培養基、胎牛血清，均購自美國Gibco公司;B細胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）抗體、β-actin抗體、Bcl-2相關X蛋白（Bax）抗體、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）抗體、mTOR抗體、PI3K抗體、Akt抗體、羊抗兔二抗均購自艾博抗（上海）貿易有限公司。

BA400Digital數碼三目攝像顯微鏡為麥克奧迪實業集團有限公司產品，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件為美國Media Cybernetics公司產品，SpectraMAX Plus384酶標儀為美谷分子儀器有限公司產品，Cytoflex流式細胞儀為美國貝克曼庫爾特公司產品。

三、方 法

1.細胞培養

將已經凍存HeLa細胞株快速在37 ℃下解凍后，加入適量高糖DMEM完全培養基（10%胎牛血清+0.5%青鏈霉素雙抗），調整細胞密度為1×106/mL，在37 ℃、5%CO2的培養箱中連續培養72 h，中途更換完全培養基2～3次，然后進行傳代備用。

2.實驗分組

濃度篩選試驗：將細胞分成5組（0、5、10、20和40 μmol/L），藥物干預48 h。機制檢測試驗：將細胞分為空白對照組、IGF-1組（100 ng/L）、RDA組（20 μmol/L）與聯合用藥組（IGF-1 100 ng/L+RDA 20 μmol/L），各組藥物均干預48 h。

3. CCK-8法檢測細胞增殖率

待HeLa細胞培養至生長對數期，加入胰蛋白酶進行消化，使用完全培養基制成單細胞懸液，將細胞密度調整為5×104/L，每孔取100 μL細胞懸液加入到96孔細胞培養板中，每孔加入100 μL完全培養基，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養24 h。待細胞完全生長貼壁后棄去培養基，使用磷酸鹽緩沖液清洗2次。將RDA溶于完全培養基，調整終濃度為0、5、10、20和40 μmol/L，每孔加入200 μL含RDA培養基，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養48 h。藥物干預48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續在培養箱培養2 h，然后使用酶標儀測定在450 nm波長下的吸光度值（A），以0 μmol/L濃度的吸光度為對照值，根據公式計算培養48 h的細胞增殖率，并計算半抑制濃度（IC50），每組3個復孔，結果取平均值。

細胞增殖率（%）=×100%

4.流式細胞術檢測細胞凋亡

將處于生長對數期的HeLa細胞用完全培養基制成1×106/mL的細胞懸液，每孔取1 mL細胞懸液加入6孔板中，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h使細胞生長貼壁，分別按照前述步驟分組培養HeLa細胞48 h，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。每組3個復孔，凋亡結果取平均值。

5.蛋白免疫印跡法檢測各蛋白表達水平

分別按照前述步驟分組培養HeLa細胞48 h，然后收集細胞行蛋白免疫印跡法檢測細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達量，并計算蛋白相對表達量。每組3個復孔，蛋白表達結果取平均值。

四、統計學處理

使用SPSS 25.0分析數據。統計數據使用 表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett-t檢驗;析因設計資料組間比較采用析因設計方差分析，交互效應有統計學意義時采用LSD-t檢驗分析單獨效應，P < 0.05表示差異具有統計學意義。

結果

一、不同濃度RDA對HeLa細胞凋亡的影響

CCK-8結果顯示，與0 μmol/L組相比，5 μmol/L 濃度以上RDA對HeLa細胞有抑制作用（P < 0.05），抑制程度與RDA濃度呈正相關，IC50為20.90 μmol/L;細胞凋亡結果顯示，5 μmol/L濃度以上RDA對HeLa有促進凋亡的作用（P

二、不同濃度RDA對HeLa細胞凋亡相關蛋白的影響

蛋白免疫印跡檢測顯示，與0 μmol/L組相比，20、40 μmol/L組中Bax和Cleaved-caspase-3的表達量均升高，Bcl-2的表達降低（P均< 0.05），0、5 μmol/L RDA對HeLa中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3凋亡蛋白表達無明顯影響，10 μmol/L RDA對Cleaved-caspase-3蛋白表達無明顯影響（P均> 0.05），見圖2、表2。

三、RDA對HeLa細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

蛋白免疫印跡檢測顯示，與0 μmol/L組相比，10、20和40 μmol/L組3種蛋白磷酸化表達量均降低（P均< 0.05）。5 μmol/L組3種蛋白磷酸化表達量有降低趨勢，但p-Akt和p-mTOR與0 μmol/L組比較差異無統計學意義（P均> 0.05），見圖2、表3。綜合前述結果，采用40 μmol/L的RDA進行后續實驗。

四、激活PI3K/Akt/mTOR通路后RDA對HeLa細胞的影響

檢測與析因分析結果顯示，IGF-1和RDA對細胞增殖率與凋亡率的主效應均有統計學意義，兩者的交互作用對細胞增殖率（F = 11.028，P = 0.006）與凋亡率（F = 48.494，P < 0.001）有影響;估算邊際平均值后發現RDA對細胞增殖率與凋亡率影響明顯，見表4。

與空白對照組相比，IGF-1組細胞增殖率與凋亡率無明顯變化（P > 0.05），RDA組與聯合用藥組細胞的增殖率下降，凋亡率上升（P < 0.05）;與IGF-1組相比，RDA組與聯合用藥組細胞的增殖率下降，凋亡率上升（P < 0.05），RDA組抑制Hela細胞增殖與促進凋亡的效果比聯合用藥組更明顯（P < 0.05），見表5、圖3。

五、激活PI3K/Akt/mTOR信號通路后RDA對HeLa細胞中該信號通路蛋白表達的影響

析因分析結果顯示，IGF-1和RDA對p-PI3K（F = 72.804，P < 0.001;F = 23.819，P = 0.001）、 p-Akt（F = 36.510，P < 0.001;F = 5.317，P < 0.001）、p-mTOR（F = 45.504，P < 0.001;F = 11.982，P = 0.009）的主效應均有統計學意義，兩者的交互效應對p-PI3K、p-Akt、p-mTOR無影響（F = 0.272，P = 0.616;F = 1.291，P = 0.289;F = 0.013，P = 0.912），估算平均邊際值后發現RDA對p-PI3K、p-Akt、p-mTOR影響明顯，見表6。故主要解析各因素的主效應作用，其中IGF-1與RDA對HeLa細胞的PI3K/Akt/mTOR信號通路影響均有統計學意義，IGF-1對PI3K/Akt/mTOR信號通路為激活效應，而RDA對PI3K/Akt/mTOR信號通路表現抑制效應，見表7、圖4。

討論

研究表明，RDA可在體外抑制多種腫瘤細胞的生長，如肝癌、乳腺癌、胃癌及卵巢癌等，說明RDA有著強大的抗腫瘤活性[5]。由此推測RDA對宮頸癌可能有一定的抗癌作用。本研究采用人宮頸癌HeLa細胞進行體外試驗，從細胞凋亡率和PI3K/Akt/mTOR信號通路等方面探討RDA對人宮頸癌細胞的抑制作用。研究結果顯示，5～40 μmol/L的RDA對HeLa細胞均有抑制作用，且抑制效果與RDA濃度呈正相關，初步顯示RDA對HeLa細胞具有明顯的抑制效果。

Caspase是一組在細胞凋亡過程起關鍵作用的酶，而Bcl家族在抑制Bcl-2或促進Bax導致細胞死亡的途徑中也起著關鍵作用[6-7]。本研究顯示，5～40 μmol/L的RDA能對HeLa細胞產生促凋亡作用，且作用隨RDA濃度的升高而增強，同時，20～40 μmol/L的RDA能使HeLa細胞中的Bcl-2蛋白表達降低，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高，這說明RDA不僅對HeLa細胞既有抑制增殖作用，也有促進凋亡作用。

PI3K/Akt/mTOR信號通路廣泛存在于多種細胞信號轉導通路中，是目前惡性腫瘤研究的熱點之一[8]。該通路在腫瘤細胞的能量代謝、細胞增殖、侵襲能力、細胞凋亡和細胞周期等生理活動中發揮重要作用[9-10]。PI3K/Akt/mTOR信號通路在許多人類惡性腫瘤（包括宮頸癌）中異常激活[11]。p-Akt和p-mTOR蛋白在50%～53%的宮頸腺癌中均有表達，說明這2種蛋白磷酸化過表達可能是導致宮頸癌的原因之一[12-13]。本研究顯示，使用RDA干預HeLa細胞后，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR這3種蛋白的相對表達量均降低，且抑制作用隨RDA濃度的升高而增強。由此說明，RDA能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，降低HeLa細胞增殖率。

IGF-1通過活化Akt激活下游信號通路，是胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）和PI3K/Akt通路的強效刺激因子[14-15]。有研究者發現，IGF-1促進多種腫瘤細胞的有絲分裂、轉移和抗凋亡，有助于腫瘤細胞的維持和促進腫瘤的進展[16]。因此本研究探討在PI3K/Akt/mTOR信號通路激活的環境下，RDA是否能發揮同樣的抗癌效果。結果顯示，IGF-1和RDA存在交互作用，RDA的單獨效應隨IGF-1變化，說明RDA可能對IGF-1誘導細胞增殖與抑制細胞凋亡的效果有抑制作用。與IGF-1組相比，聯合用藥組能明顯降低細胞增殖率且提高細胞凋亡率，但效果不如單用RDA，說明在IGF-1的干預下，RDA仍然能發揮抑制腫瘤細胞生存的效果。進一步研究發現，IGF-1和RDA的交互作用并沒有對p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達量產生影響，說明IGF-1此時的作用只是單純的PI3K/Akt/mTOR信號通路激動劑，并未對RDA產生直接影響。與空白對照組相比，IGF-1組的p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達量升高，說明IGF-1激活了HeLa細胞中的PI3K/Akt/mTOR信號通路。而RDA能降低IGF-1干預后p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達量，說明無論PI3K/Akt/mTOR信號通路是處于正常狀態還是異常激活狀態，RDA都能抑制HeLa細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路中PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化，從而誘導HeLa細胞死亡，阻止腫瘤細胞的增殖。

綜上所述，RDA能對人宮頸癌HeLa細胞產生抑制增殖與促進凋亡的作用，其作用機制是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，降低p-PI3K、? p-Akt和p-mTOR蛋白的表達，產生抗癌的效果。

參 考 文 獻

[1] Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin， 2018， 68（6）：394-424.

[2] Wang L， Liu Y， Zhou Y， et al. Zoledronic acid inhibits the growth of cancer stem cell derived from cervical cancer cell by attenuating their stemness phenotype and inducing apoptosis and cell cycle arrest through the Erk1/2 and Akt pathways. J Exp Clin Cancer Res， 2019， 38（1）： 93.

[3] Wang Z， Shen J， Sun W， et al. Antitumor activity of Raddeanin A is mediated by Jun amino-terminal kinase activation and signal transducer and activator of transcription 3 inhibition in human osteosarcoma. Cancer Sci， 2019， 110（5）： 1746-1759.

[4] Teng Y H， Li J P， Liu S L，et al. Autophagy protects from raddeanin A-induced apoptosis in SGC-7901 human gastric cancer cells. Evid Based Complement Alternat Med， 2016， 2016： 9406758.

[5] Meng C， Teng Y， Jiang X. Raddeanin A induces apoptosis and cycle arrest in human HCT116 cells through PI3K/AKT pathway regulation in vitro and in vivo. Evid Based Complement Alternat Med， 2019， 2019： 7457105.

[6] Xue G， Zou X， Zhou J Y， et al. Raddeanin A induces human gastric cancer cells apoptosis and inhibits their invasion in vitro. Biochem Biophys Res Commun， 2013， 439（2）： 196-202.

[7] 邱杰洪， 張昌林， 李田. 間充質干細胞條件培養基對HPV18型陽性人子宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響. 新醫學， 2021， 52（4）： 278-282.

[8] 陳鳳霞. 宮頸癌病情進展過程中PI3K/AKT/mTOR信號通路的變化及靶基因的探究. 海南醫學院學報， 2018， 24（19）： 1757-1761.

[9] Sechler M， Cizmic A D， Avasarala S， et al. Non-small-cell lung cancer： molecular targeted therapy and personalized medicine-

drug resistance， mechanisms， and strategies. Pharmgenomics Pers Med， 2013， 6： 25-36.

[10] Asati V， Mahapatra D K， Bharti S K. PI3K/Akt/mTOR and Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathways inhibitors as anticancer agents： structural and pharmacological perspectives. Eur J Med Chem， 2016， 109： 314-341.

[11] Dong P， Hao F， Dai S， et al. Combination therapy Eve and Pac to induce apoptosis in cervical cancer cells by targeting PI3K/AKT/mTOR pathways. J Recept Signal Transduct Res， 2018， 38（1）： 83-88.

[12] Gao Y， Ma C， Feng X， et al. BF12， a novel benzofuran， exhibits antitumor activity by inhibiting microtubules and the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in human cervical cancer cells. Chem Biodivers， 2020， 17（3）： e1900622.

[13] 張艷， 劉耀基， 侯桂琴， 等. mTOR通路增強宮頸癌紫杉醇耐藥細胞株HeLa/PTX對紫杉醇的敏感性. 沈陽藥科大學學報， 2019， 36（3）： 254-260.

[14] Renna M， Bento C F， Fleming A， et al. IGF-1 receptor antagonism inhibits autophagy. Hum Mol Genet， 2013， 22（22）： 4528-4544.

[15] Tang W， Feng X， Zhang S， et al. Caveolin-1 confers resistance of hepatoma cells to anoikis by activating IGF-1 pathway. Cell Physiol Biochem， 2015， 36（3）： 1223-1236.

[16] Teng J A， Wu S G， Chen J X， et al. The activation of ERK1/2 and JNK MAPK signaling by insulin/IGF-1 is responsible for the development of colon cancer with type 2 diabetes mellitus. PLoS One， 2016， 11（2）： e0149822.

（收稿日期：2021-05-10）

（本文編輯：林燕薇）