不同濃度薏苡仁提取物對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制

樊 玲，趙景杰

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)約占全部口腔癌的90%，是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，因局部侵襲性和頸部淋巴結轉移率較高，OSCC的5年生存率僅為60%[1]。最差浸潤方式代表腫瘤侵襲性，已成為影響OSCC預后的重要組織病理學因素，最差浸潤方式分級越高患者復發率越高，術后生存時間越短[2]。HE等[3]研究指出，腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的關鍵因素之一為血小板源性生長因子及其受體間的相互作用。血小板源性生長因子B(PDGFB)與血小板源性生長因子受體β(PDGFRβ)相互作用，誘導PDGFRβ磷酸化并激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，而細胞增殖、存活和血管生成等多種生理活動都離不開PI3K信號傳導通路，提示該通路可能是潛在的抗腫瘤治療靶點[4-5]。薏苡仁為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁，味甘淡，性微寒，薏苡仁提取物已證明在抗氧化、增強免疫、抗腫瘤等多方面有良好的作用，但目前薏苡仁提取物對OSCC的抗腫瘤作用相關研究較少[6]。故本研究通過觀察不同作用濃度薏苡仁提取物對人OSCC CAL27細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其潛在作用機制，旨在為OSCC治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 薏苡仁提取物(西安金綠生物工程技術有限公司，批號：1312046-3)；RPMI-1640培養基、10%胎牛血清(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：HB-FBS-1B、HB-FBS-500)；結晶紫染液、聚偏氟乙烯膜、細胞蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：P0033、C1027、SF4033)；PDGFB、PDGFRβ、磷酸化PDGFRβ(p-PDGFRβ)、PI3K、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)和β-actin抗體(美國Santa Cruz公司，批號：HZ-06458、HZ-064458、HZ-0684R2、HZ-0670R18、HZ-0611R18、HZ-4856R48和HZ-0742R1)；辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：115-58-264)。

1.2實驗細胞培養及分組 人OSCC CAL27細胞購自中國典型培養物保藏中心，批號：CM-1250。37 ℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，取對數生長期細胞進行實驗，分為高劑量組、低劑量組、對照組。高、低劑量組分別予20、10 μmol/L薏苡仁提取物干預[6]，對照組不予任何干預。各項指標檢測均設4個復孔。

1.3MTT法檢測細胞增殖率 各組以每孔5×103個細胞濃度接種于96孔板，待細胞融合后按“1.2”項方法干預24 h后加入MTT(每孔20 μl)，37 ℃條件下繼續培養4 h，酶標儀測定630 nm處吸光度(OD)值計算細胞增殖率，空白組為只添加培養基細胞，細胞增殖率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。

1.4細胞劃痕法檢測細胞遷移能力 各組以每孔5×104個細胞濃度接種于6孔板中，待細胞融合，于單層細胞上用滅菌槍頭做“一”字劃痕，無血清RPMI-1640培養基清洗3次，按“1.2”項方法干預24 h后顯微鏡拍照，圖像分析儀測量劃痕寬度。

1.5Transwell法檢測細胞體外侵襲能力 各組以每孔5×104個細胞濃度接種于24孔Transwell小室中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，按“1.2”項方法干預24 h，取出小室，PBS洗滌后4%甲醛固定10 min，用0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下計數紫色穿膜細胞數。

1.6蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達 各組以每孔5×104個細胞濃度接種于6孔板中，待細胞融合按“1.2”項方法干預24 h后獲取細胞，據細胞量加入細胞蛋白抽提試劑裂解2 h；經SDS凝膠電泳后轉至聚偏氟乙烯膜上，后用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，然后加入PDGFB(1∶250)、PDGFRβ(1∶200)、p-PDGFRβ(1∶500)、PI3K(1∶300)、Akt(1∶200)、p-Akt(1∶300)和β-actin(1∶1000)抗體4 ℃條件下孵育過夜，TBST緩沖液沖洗膜2次，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)室溫下孵育30 min后顯色，采集圖像分析。

2 結果

2.1不同濃度薏苡仁提取物對CAL27細胞增殖率和遷移能力的影響 高、低劑量組細胞增殖率和遷移能力明顯低于對照組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見表1、圖1和圖2。

表1 不同濃度薏苡仁提取物對口腔鱗狀細胞癌CAL27細胞增殖和遷移能力的影響

圖2 不同濃度薏苡仁提取物對口腔鱗狀細胞癌CAL27細胞遷移能力的影響

2.2不同濃度薏苡仁提取物對CAL27細胞侵襲的影響 對照組細胞侵襲數為(510.08±91.54)個，低、高劑量組細胞侵襲數分別為(257.89±56.28)個、(182.61±30.72)個。高、低劑量組細胞侵襲數低于對照組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同濃度薏苡仁提取物對口腔鱗狀細胞癌CAL27細胞侵襲的影響(結晶紫染色×200)

2.3不同濃度薏苡仁提取物對CAL27細胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達的影響 高、低劑量組PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達低于對照組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見表2、圖4。

圖4 不同濃度薏苡仁提取物對口腔鱗狀細胞癌CAL27細胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達的影響

表2 不同濃度薏苡仁提取物對口腔鱗狀細胞癌CAL27細胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達的影響

2.4不同濃度薏苡仁提取物對CAL27細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達的影響 3組Akt蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；高、低劑量組PI3K和p-Akt蛋白表達低于對照組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見表3、圖5。

表3 不同濃度薏苡仁提取物對口腔鱗狀細胞癌CAL27細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達的影響

圖5 不同濃度薏苡仁提取物對口腔鱗狀細胞癌CAL27細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達的影響

3 討論

目前，OSCC發病率較高，多數患者因腫瘤復發或轉移而造成死亡。故亟須尋找可以對OSCC細胞增殖和遷移起抑制作用的有效藥物。薏苡仁甘油酯為薏苡仁提取物的主要成分，其成品制劑康萊特注射液已用于臨床，對多種惡性腫瘤具有較好療效，可明顯促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖，并顯著提高患者機體免疫功能[7-8]。然而，其具體的作用機制及最佳作用濃度仍不十分清楚。故本研究評估不同濃度薏苡仁提取物對人OSCC CAL27細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及作用機制，研究結果顯示，高、低劑量組細胞增殖率、遷移能力、細胞侵襲數低于對照組，且高劑量組低于低劑量組。提示薏苡仁提取物可能是OSCC的潛在治療靶點，且干預濃度越高抗腫瘤作用越佳。分析產生上述結果的原因為，薏苡仁提取物通過阻斷G2與M期腫瘤細胞進入G0、G1期，并減少S期腫瘤細胞比例，減少細胞分裂，從而抑制腫瘤細胞增殖或腫瘤血管生成，起到良好的抗腫瘤效應。

PDGF是體外平滑肌細胞和成纖維細胞的主要促分裂原[9]。HOSAKA等[10]研究指出，腫瘤細胞增殖、遷移以及功能性脈管系統發育的關鍵為PDGFB和PDGFRβ間的相互作用。ZHOU等[11]研究顯示，上調PDGFB表達可刺激血管損傷大鼠模型頸動脈平滑肌細胞的增殖和遷移，提示PDGFB有助于動物模型血管損傷后的修復或重塑。TANNENBERG等[12]研究還發現，減少血管成形術后血管修復和重塑的關鍵是抑制PDGFB信號傳導通路活性。VU等[13]和FORTE等[14]研究認為，在多種上皮癌自分泌刺激腫瘤生長及旁分泌刺激腫瘤相關血管生成過程中，PDGFB和PDGFRβ起關鍵作用。有研究顯示，PDGFB主要在OSCC組織腫瘤細胞中表達升高[15]，激活PI3K/Akt信號傳導通路可誘導腫瘤細胞生長并促進上皮間質轉化和腫瘤細胞轉移[16-17]。本研究結果顯示，高、低劑量組PDGFB、PDGFRβ、p-PDGFRβ、PI3K、p-Akt蛋白表達低于對照組，且高劑量組低于低劑量組。提示薏苡仁提取物可能是通過抑制PDGFB表達，阻斷PDGFRβ磷酸化并抑制PDGFB/PDGFRβ/PI3K/Akt軸活性，從而抑制人OSCC CAL27細胞增殖、遷移和侵襲能力，且干預濃度越高抗腫瘤效果越佳。

綜上所述，薏苡仁提取物可抑制人OSCC CAL27細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與抑制PDGFB/PDGFRβ/PI3K/Akt軸活性有關，且干預濃度越高抗腫瘤效果越佳，為薏苡仁提取物對OSCC的分子靶向治療提供新的理論依據。