撫順某奶牛場隱性乳房炎病原菌耐藥性的調查研究

宋淑英

（遼寧省農業發展服務中心，遼寧沈陽 110064）

奶牛隱性乳房炎（diary cow subclinical mastitis）是奶牛養殖過程中的常見疾病[1-3]。奶牛隱性乳房炎無明顯臨床癥狀，發病隱蔽不易察覺，但此時乳區內體細胞數已明顯升高，對乳品質和產量影響巨大，是制約乳產業健康發展的重要疾病之一[4-9]。隱性乳房炎病因眾多，機械刺激、遺傳因素、營養因素均可誘發該病，其中，病原微生物感染是最主要的病因之一[10-11]。目前，針對病原菌感染使用抗生素仍是獸醫臨床治療奶牛隱性乳房炎的首選方法，但隨著抗菌藥物不斷使用，病原菌耐藥性也逐漸增強，不僅加大了疾病治療難度，也增加了動物性食品抗生素殘留的風險[12-13]。本研究對撫順某規模化奶牛養殖場隱性乳房炎患病情況進行流行病學調查，同時對其主要病原菌進行分離鑒定，評估病原菌分離株的耐藥性水平，為該場奶牛隱性乳房炎治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

試驗于撫順某規模化奶牛養殖場進行樣品采集，選取臨床表現正常、乳區泌乳功能良好、乳汁性狀正常的泌乳期奶牛600頭。

1.1.2 主要儀器

LS-35LD立式蒸汽高壓滅菌器（上海力辰儀器科技有限公司）、HSP80B恒溫振蕩生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、SDD-60KD恒溫隔水式培養箱（紹興蘇珀一起有限公司）、SJ-3084S無菌工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、200μL F3移液器（北京賽默飛世爾科技）。

1.1.3 主要試劑

普通固體營養瓊脂培養基、普通營養肉湯培養基、麥康凱瓊脂粉，均購自青島海博生物技術有限公司；高鹽甘露醇培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄球菌屬細菌生化鑒定管、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（20種）購自杭州微生物試劑有限公司；奶牛隱性乳房炎檢測液（蘭州利拉伐CMT套裝）由飼養場提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 隱性乳房炎篩查

采樣奶牛適當保定，對4個乳區進行碘酊-酒精-碘酊的消毒步驟。每個乳區棄去頭3把奶，分別擠5～10 mL乳樣至CMT檢測搖盤。每個搖盤中分別加入等量的CMT檢測液，水平方向輕搖3～5圈后靜置，觀察顏色變化。采集隱性乳房炎乳區的乳樣10～15 mL于滅菌離心管，標記好的離心管置于4℃樣品冷藏保存盒，盡快送至實驗室。

1.2.2 病原菌初步分離

按照產品說明書要求，配制普通固體營養瓊脂培養基、普通營養肉湯培養基、麥康凱瓊脂培養基、高鹽甘露醇瓊脂培養基。將配制好的培養基經37℃恒溫培養箱過夜檢菌，檢菌合格的培養基4℃密封保存。

取100μL隱性乳房炎乳樣，均勻涂布于普通營養瓊脂培養基，正置于無菌工作臺中片刻，待乳樣充分吸收后倒置，37℃恒溫培養12 h。在培養后的瓊脂平板中挑取菌落形態、生長形狀不同的單獨菌落，分別接種于普通營養肉湯培養基中，37℃180 r/min培養12 h，標記后于終濃度為30%的甘油中-80℃保存、待檢。

取待檢甘油菌，分別涂布于麥康凱瓊脂平板和高鹽甘露醇瓊脂平板中，同普通瓊脂平板培養條件，對病原菌進行初步分離[10]。

1.2.3 病原菌生化反應鑒定

在麥康凱瓊脂平板中選取圓形、具有紅色金屬光澤的典型菌落；在高鹽甘露醇瓊脂平板中選取圓形、淡黃色、菌落周圍呈明顯黃色的針尖狀菌落，分別采用腸桿菌科細菌生化鑒定管和葡萄球菌屬細菌生化鑒定管，對其進行生化反應鑒定。將細菌接種于微量鑒定管后，加入1滴液體石蠟封閉鑒定管，37℃恒溫封口培養過夜。觀察反應管顏色變化，并根據細菌編碼手冊對病原菌進行賦碼、鑒定。

1.2.4 病原分離株藥敏試驗

將鑒定后的主要病原菌分離株均勻涂布于90 mm固體瓊脂平皿中，待菌液吸收后將藥敏紙片均勻放置于平皿內，藥敏紙片間預留足夠距離以便測量抑菌環直徑。平皿37℃恒溫培養12 h，游標卡尺測量抑菌環直徑，取3次測量結果的平均值為該藥物對病原菌分離株的抑菌直徑，并與參考值進行比較，評估病原分離株對藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 隱性乳房炎篩查結果

在該場調查的600頭奶牛2 400個乳區中，發現28頭為隱性乳房炎陽性病牛，患病乳區47個。該場奶牛隱性乳房炎患病率為4.67%，乳區陽性率為1.96%。

2.2 隱性乳房炎病原菌分離鑒定結果（見圖1）

圖1 隱性乳房炎病原菌分離鑒定結果Fig.1 Pathogenic bacteria isolation and identification result of subclinical mastitis

由圖1可知，陽性病料經麥康凱及高鹽甘露醇鑒別培養基，初步分離到疑似腸桿菌科分離株56株、葡萄球菌屬分離株63株。上述病原菌分離株經生化反應鑒定、編碼對比，最終確定病原菌76株，其中大腸桿菌分離株31株、金黃色葡萄球菌38株、表皮葡萄球菌6株、腐生葡萄球菌1株。該場奶牛隱性乳房炎主要病原菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，占比分別為50%（38/76）及40.8%（31/76）。

2.3 隱性乳房炎主要病原菌耐藥性結果（見表1）

對本試驗分離到的38株金黃色葡萄球菌及31株大腸桿菌分離株進行藥敏紙片抑菌試驗，結果表明，2種病原菌對受試的臨床常用20種抗生素均產生不同程度的耐藥性。

由表1可知，金黃色葡萄球菌分離株對磺胺類藥物的復方新諾明和磺胺甲基異惡唑耐藥率較高，分別為71.1%及57.9%；其他耐藥率相對較高的藥物為慶大霉素、四環素及鏈霉素，耐藥率分別為52.6%、47.4%及44.7%。金黃色葡萄球菌對頭孢菌素類及青霉素類藥物敏感性相對較高，尤其是頭孢菌素類，頭孢拉定和頭孢曲松各僅有1株（2.6%）分離株對其耐藥。

表1 隱性乳房炎主要病原菌耐藥性結果Tab.1 Antibiotics resistance result of major pathogenic bacteria isolated from subclinical mastitis

在31株大腸桿菌分離株中，絕大多數分離株對受試藥物均表現較高的耐藥性，如對復方新諾明、磺胺甲基異惡唑、卡那霉素、青霉素及紅霉素均表現高度耐藥，耐藥率分別為90.3%（28/31）、96.8%（30/31）、87.1%（27/31）、80.6%（25/31）及80.6%（25/31）。大腸桿菌僅對頭孢菌素類藥物敏感，對頭孢拉定及頭孢曲松敏感率為67.7%（21/31）及64.5%（20/31）。

對病原菌分離株進行多藥耐藥分析，結果顯示，65.8%（25/38）的金黃色葡萄球菌及77.4%（24/31）的大腸桿菌分離株為多藥耐藥菌株（同時耐受至少3類抗菌藥物）。在金黃色葡萄球菌中，同時耐受4類藥物的分離株占比最高，為42.1%（16/38）；在大腸桿菌中，同時耐受5類藥物的分離株占比最高，為35.5%（11/31）。在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中均有分離株耐受所有種類受試藥物。

3 討論

奶牛隱性乳房炎具有隱蔽性強、流行范圍廣的特點，對奶牛養殖業及乳產業造成了嚴重的經濟損失。目前，抗生素療法是臨床治療隱性乳房炎的首選方案，但隨著藥物的不斷使用，病原菌在抗生素的選擇壓力作用下逐漸產生耐藥性，給臨床疾病治療和動物性食品安全帶來挑戰。因此，對奶牛隱性乳房炎展開流行病學調查及病原耐藥性研究意義重大。

本研究對遼寧撫順某規模化奶牛養殖場進行隱性乳房炎病原耐藥性研究，結果表明，該場奶牛隱性型乳房炎患病率為4.67%、乳區陽性率為1.96%，與其他地區報道數據相比患病率相對較低。

王勇民[7]報道，河南地區規模化和散養戶奶牛隱性乳房炎發病率分別為45.3%和57.1%。呂倩等[8]報道，四川地區奶牛隱性乳房炎總發陽性率為19.0%。韓曉霞等[9]報道，陜西地區規模化奶牛養殖場隱性乳房炎發病率為10.6%。馬博等[2]報道，新疆地區隨機抽樣檢測奶牛隱性乳房炎患病率為24%。劉霄等[11]報道，昆明地區規模化奶牛養殖場隱性乳房炎陽性率為28.79%、散養戶陽性率為56.21%。李艷菊等[13]報道，天山北坡奶牛隱性乳房炎總體患病率為21.0%，且高產奶牛發病率顯著低于低產奶牛。楊興斌[14]報道，甘肅地區奶牛隱性乳房炎患病率為49.17%，且陰性乳房炎患病率與奶牛胎次呈明顯正相關。與報道數據相比，本研究中奶牛養殖場隱性乳房炎陽性率相對較低，可能與該場日常飼養管理因素有關。養殖場能夠經常對奶牛進行體細胞計數檢測、CMT日常篩查等，可盡早發現陽性病例并進行積極干預。

本研究對分離到的主要病原菌（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）進行藥物敏感性測試。結果表明，兩種病原菌分離株對磺胺類藥物均表現較高的耐藥性，對其他受試藥物也表現出不同程度的耐受；兩種病原菌分離株均對頭孢菌素類藥物較為敏感。

馬博等[2]報道，新疆地區陰性乳房炎金黃色葡萄球菌對青霉素、鏈霉素、環丙沙星耐藥率為100%，對阿莫西林耐藥率為80.8%、對慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、頭孢氨芐耐藥率為5.7%，對多西環素、克林霉素、四環素耐藥率為0。鄧凱偉等[4]報道，信陽地區隱性乳房炎大腸桿菌對萬古霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環丙沙星、呋喃妥因高度敏感，對紅霉素中度敏感，對克林霉素、克拉霉素、米諾環素、復方新諾明低度敏感，對大觀霉素、四環素、青霉素G、苯唑西林、多黏菌素B耐藥。李希強等[15]報道，內蒙古地區隱性乳房炎金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對慶大霉素、美羅培南、環丙沙星、磷霉素敏感，對四環素、頭孢他啶、氟苯尼考耐藥性較高。本研究結果與上述結論中耐藥性、耐藥譜等方面存在差異，可能是由于地理位置及日常治療用藥方案等不同所致。

4 結論

對病原菌分離株多藥耐藥情況分析發現，本研究得到的分離株均表現出較為嚴重的多藥耐藥現象，42.1%的金黃色葡萄球菌同時耐受4類藥物，35.5%的大腸桿菌同時耐受5類藥物。耐藥性菌株，特別是多藥耐藥菌株的大量存在，可對疾病治療及預防造成嚴重威脅。建議該場根據研究結果合理制定治療方案。