遼寧西部地區綿羊住肉孢子蟲的分離鑒定與遺傳進化分析

宋 錚，鄭毓秀，王大為，劉孝剛

（錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州 121001）

住肉孢子蟲（Sarcocystis）屬孢子蟲綱、真球蟲目、肉孢子蟲科、孢子蟲屬，能夠感染人和多種動物，是一種重要的人畜共患寄生蟲病，通常以馬、牛羊、豬等作為中間宿主，食肉動物和人作為終末宿主[1]。住肉孢子蟲在中間宿主的橫紋肌、心肌等肌肉組織中形成包囊，引起畜禽發病，可對畜禽產品的衛生質量和安全性造成嚴重影響[2]。人類食用含有包囊蟲體的肌肉組織后，能夠引起惡心、頭疼、腹瀉、消瘦、嘔吐、貧血等癥狀[3]，可對人類健康和畜牧業發展構成嚴重威脅。

綿羊是住肉孢子蟲的重要中間宿主，綿羊感染住肉孢子蟲后可出現食欲下降、消瘦、肌肉炎癥、流產、早產等癥狀，嚴重者可導致羊死亡[4-5]。遼寧西部地區是遼寧省重要的綿羊產區，在以往的文獻中雖然已有綿羊住肉孢子蟲流行病學方面的研究[6-8]，但有關綿羊住肉孢子蟲的種類及遺傳進化關系的研究尚未見報道。本研究旨在闡明該地區綿羊住肉孢子蟲的蟲體種類以及遺傳進化關系，以期為相關研究、診斷與防治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）購自天根生化科技有限公司產品；2×Es Taq Master Mix（Dye）購自康為世紀生物科技有限公司；DL2000 DNA Maker購自寶日醫生物技術有限公司；G8140綠色熒光核酸染料（10 000×）、瓊脂糖，均購自索萊寶生物科技有限公司。

主要儀器：BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、T960熱循環儀（杭州晶格科學儀器有限公司）、Tanon 2500R全自動數碼凝膠圖像分體（上海天能科技有限公司）、JB-CJ-2FD超凈臺（蘇州凈化工程設備有限公司）、HH-6020恒溫水槽（常州萬科儀器科技有限公司）、低溫高速離心機（長沙英泰儀器有限公司）、BM2000生物顯微鏡（Olympus）、JE602電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）、Reference移液器（Eppendorf公司）。

1.2 樣品采集

遼寧西部地區3個農貿市場隨機采集23份新鮮綿羊膈肌樣品，標號，放入冰盒內保存并運送至實驗室，-20℃保存，用于后續顯微鏡壓片鏡檢和DNA提取。

1.3 壓片鏡檢法檢測

將樣品剪成麥粒大小，剔除膈肌上的脂肪和筋膜，置于兩片載玻片間，將樣品壓薄制成壓片標本。膈肌壓片標本厚度為能夠清晰看到下面報紙上的字樣即可，棉線固定載玻片，置于光學顯微鏡下觀察。

每份樣品檢測15張壓片標本，15張壓片標本全部陰性者則該份樣品標記為陰性，15張壓片標本中出現1份或1份以上陽性者則該份樣品標記為陽性，統計記錄檢測結果并拍照留存。

1.4 鏡檢疑似陽性樣品DNA提取

分別研磨顯微鏡壓片鏡檢法獲得的陽性膈肌樣品，加適量生理鹽水混勻，研磨所得組織液倒入1.5 mL離心管，12 000 r/min離心1 min，棄掉上清，加200μL磷酸鹽緩沖液，振蕩至徹底懸浮，加入20μL蛋白酶K（Proteinase K），56℃水浴消化1～3 h直至組織徹底溶解。按照血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒說明書操作方法提取蟲體DNA，DNA樣品-20℃保存。

1.5 引物合成與目的基因片段擴增

根據GenBank所登錄的cox1基因序列（登錄號：KP263744.1），設計一對特異性擴增引物：上游引物cox1-F：5'GTATGTACGTACTTACGGC3'；下游引物：cox1-R：5'CAGTCAACGGCCTCCGTATT3'。

PCR反應體系（20μL）：模板DNA 5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2×Es Taq Master Mix 10μL、ddH2O 3μL。

PCR反應條件為：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，74℃30 s，35個循環；74℃5 min。

將所得PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，通過全自動數碼凝膠成像系統進行結果觀察和圖片保存。切膠回收PCR結果陽性條帶，并將回收產物與T載體連接、轉化、克隆，將PCR鑒定為陽性的菌液送至生物公司測序。

1.6 序列同源性比對與遺傳進化分析

將測序所得序列與GeneBank中收錄的綿羊住肉孢子蟲分離株pcox1序列信息進行比較分析。以弓形蟲（Toxoplasma gondii）為外群，通過MEGA 5.05軟件校對序列，保存文件，通過DNASTAR中的MegAlign程序將樣品序列及GenBank中已收錄的住肉孢子蟲cox1序列進行分析，比較其同源性和差異性，生成多重序列對比圖；利用MEGA5.05軟件，以鄰接法（neighbor-joining method）將上述所有序列構建系統發育進化樹以分析遺傳進化關系。綿羊不同住肉孢子蟲分離株的pcox1序列信息見表1。

表1 綿羊不同住肉孢子蟲分離株的pcox1序列信息Tab.1 Sequence information of pcox1 of different Sarcocystis isolates in sheep

2 結果與分析

2.1 遼西地區綿羊住肉孢子蟲壓片鏡檢法檢測結果（見圖1）

圖1 遼西地區綿羊住肉孢子蟲壓片鏡檢法檢測結果Fig.1 Results of compression microscopy in western Liaoning Province

通過壓片鏡檢法檢測發現，所采集的23份樣品中共有11份樣品感染住肉孢子蟲，分離率達47.8%。將11株住肉孢子蟲陽性樣品分別命名并編號為遼西1號～遼西11號（LX1～LX11）。

由圖1可知，光學顯微鏡下檢測樣品壓片標本，住肉孢子蟲包囊分布于綿羊膈肌的肌纖維間，包囊大多數呈彎曲的長橢圓形或梭形。

2.2 遼西地區綿羊住肉孢子蟲pcox1擴增產物的瓊脂糖電泳分析（見圖2）

圖2 遼西地區綿羊住肉孢子蟲pcox1擴增產物的瓊脂糖電泳分析Fig.2 Agarose electrophoresis analysis of the amplified product of Sarcospora pcox1 in western Liaoning Province

由圖2可知，經PCR鑒定，11份陽性樣品均成功擴增出約397 bp的片段，與預期片段大小相符，陰性對照無條帶，說明成功擴增出目的基因。

2.3 遼西地區綿羊住肉孢子蟲pcox1序列差異性比對（見圖3）

圖3 遼西地區綿羊住肉孢子蟲pcox1序列差異性比對Fig.3 Alignment of pcox1 sequence differences of sheep Sarcocystis in western Liaoning Province

由圖3可知，11株住肉孢子蟲間序列同源性較高，同源性為96.2%～100.0%。與GeneBank中收錄的2株柔嫩住肉孢子蟲分離株（登錄號：KP263744.1和MH413045.1）的序列同源性分別為96.2%～99.7%和94.4%～97.9%，與其他4株住肉孢子蟲分離株（登錄號：MH413047.1、MK419975.1、MK420011.1、MT722969.1）的同源性均小于72.2%，種內差異（0～5.8%）小于種間差異（11.3%～35.5%）。

同源性分析結果表明，本次分離到的綿羊住肉孢子蟲均為柔嫩住肉孢子蟲。

2.4 遼西地區綿羊住肉孢子蟲分離株系統發育樹（見圖4）

由圖4可知，分離得到的11株住肉孢子蟲具有高度相似性，與GenBank中已報道的2個柔嫩住肉孢子蟲分離株（S.tenellaisolate 1和S.tenellaisolate 1cST）屬同一分支，并且與GenBank中收錄的其他種類住肉孢子蟲分支較遠。

圖4 遼西地區綿羊住肉孢子蟲分離株系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of sheep Sarcocystis isolates in western Liaoning Province

遺傳進化分析結果進一步證實，本試驗在遼寧西部地區分離到的綿羊住肉孢子蟲均為柔嫩住肉孢子蟲。

3 討論

3.1 住肉孢子蟲的分離鑒定方法

住肉孢子蟲的分離鑒定方法主要包括傳統的形態學觀察和分子生物學檢測等。形態學觀察主要采用顯微鏡對肌肉組織壓片進行觀察鑒定，該方法簡單實用，主要應用于住肉孢子蟲的初步鑒定，但難以區分住肉孢子蟲的具體種類[9]。分子生物學檢測方法具有敏感性高、特異性強的特點，是目前應用于住肉孢子蟲分離鑒定以及遺傳進化分析的主要分子手段[3]，常應用于住肉孢子蟲檢測的基因，包括5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA和cox1基因；其中cox1基因序列相對保守，故在住肉孢子蟲的分類鑒定及遺傳進化分析方面被認為是理想的遺傳標記[10-11]。目前，國際上廣泛認同的應用于住肉孢子蟲種類鑒定的分子生物學方法是cox1基因分子生物學信息分析方法[12-15]。

3.2 住肉孢子蟲的蟲體種類

目前，世界范圍內報道的住肉孢子蟲的蟲體種類超過200種[3]，其中綿羊住肉孢子蟲有4種，分別為柔嫩住肉孢子蟲（Sarcocystis tenella）、巨型住肉孢子蟲（Sarcocystis gigantean）、白羊犬肉孢子蟲（Sarcocystis arieticanis）、水母形住肉孢子蟲（Sarcocystis medusiformis）。我國報道的綿羊住肉孢子蟲主要有3種，分別為柔嫩住肉孢子蟲、巨型住肉孢子蟲和白羊犬肉孢子蟲[10]。

3.3 遼西地區綿羊住肉孢子蟲的分離鑒定

本研究采用傳統的形態學觀察和分子生物學檢測方法，開展了遼寧西部地區綿羊住肉孢子蟲的蟲體種類鑒定和遺傳進化分析工作。通過壓片鏡檢法分離到11株住肉孢子蟲，蟲體包囊分布與膈肌的肌纖維之間，包囊大多數呈彎曲的長橢圓形或梭形，符合住肉孢子蟲的形態學特征[12]；PCR檢測發現，在11份陽性樣品中均擴增出大小約397 bp的片段，與預期片段一致；同源性分析發現，樣本分離的綿羊住肉孢子蟲與GenBank中的2株柔嫩住肉孢子蟲的同源性最高，分別為96.2%～99.7%和94.4%～97.9%；系統進化樹分析顯示與柔嫩住肉孢子蟲位于同一分支。

4 結論

本研究結果表明，試驗中從遼寧西部地區分離到的綿羊住肉孢子蟲為柔嫩住肉孢子蟲。本研究結果可為該地區綿羊住肉孢子蟲流行病學研究及診斷與防治工作提供一定參考。