新疆邊境昆玉市亞洲璃眼蜱形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定

周 鵬，李 正，張生帥，李 川，向鄭琬琪，武軍元*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆阿拉爾 843300；3.新疆巴州尉犁縣第二師三十三團(tuán)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆巴音郭楞 841505）

蜱屬節(jié)肢動物門、蛛形綱、寄螨目、蜱總科，是一類寄生于哺乳動物、爬行類、鳥類和兩棲類等脊椎動物體表的專性吸血寄生蟲，是多種自然疫源性疫病的傳播媒介及病原的貯存宿主[1-3]，可攜帶并傳播病毒、細(xì)菌、立克次體和原蟲等多種病原微生物。蜱分為硬蜱科、軟蜱科、納蜱科和恐蜱科，其中以硬蜱科危害最嚴(yán)重[4]。截至目前，世界上蜱總科有21個屬，共計960種，其中硬蜱科有14屬740種，軟蜱科有5屬218種，納蜱科和恐蜱科各1種[5-6]。中國已報道的蜱類有2科9屬124種，其中軟蜱科2屬14種，硬蜱科有7屬110種[5,7-10]。

現(xiàn)有研究普遍認(rèn)為，蜱傳疫病與特定的蜱種有關(guān)，而蜱種分布與地理緯度有關(guān)。新疆地貌景觀復(fù)雜多樣，為多種蜱蟲提供了繁衍生息所需的適宜條件。于心等[11]整理編著出版的《新疆蜱類志》報道了20世紀(jì)50年代至1995年新疆區(qū)域內(nèi)分布的蜱種種類，是新疆蜱類研究相對較系統(tǒng)的成果。近年來，新疆南疆塔克拉瑪干沙漠邊緣亦出現(xiàn)新蜱種鑒定的報道[12]。昆玉市位于新疆南疆和田地區(qū)邊陲，屬典型的沙漠氣候，該地區(qū)蜱種鑒定的報道相對較少。為進(jìn)一步了解新疆南疆地區(qū)的蜱類分布組成，本研究采用形態(tài)學(xué)方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對昆玉市駱駝體表寄生的蜱蟲進(jìn)行了分析鑒定，以期豐富相關(guān)資料及研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蜱樣來源

從新疆南疆和田地區(qū)昆玉市昆泉鎮(zhèn)散養(yǎng)駱駝體表采集寄生的蜱蟲，共獲得硬蜱150只。采集的蜱蟲采用75%酒精浸泡，常溫條件運送至新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室。

1.1.2 主要試劑

TransTaq?-T DNA Polymerase、Trans2K?DNA Marker、EasyPure? PCR Purification Kit、EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GeneGreen核酸染料（RT210）、DNase/RNase-Free去離子水（RT121）、2×Taq Plus PCR MasterMix（KT205）、DH5a感受態(tài)細(xì)胞（CB101）、pGM-T載體相關(guān)試劑盒購自天根生化科技有限公司；血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒（DP304）購自天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

T100TMThermal Cycler（Bio-rad公司）、全自動蛋白免疫印跡定量分析系統(tǒng)（普諾森生物科技有限公司）、臺式高速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津歐諾儀器股份有限公司）。

電熱恒溫培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、SW-CJ-2FD凈化工作臺（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

參考文獻(xiàn)[13]設(shè)計蜱種鑒定的特異性引物，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.2 蜱形態(tài)學(xué)鑒定

將自新疆南疆和田地區(qū)昆玉市昆泉鎮(zhèn)散養(yǎng)駱駝體表采集寄生的蜱蟲依次采用不同梯度的酒精溶液振蕩漂洗5次，以滅菌的ddH2O振蕩漂洗1次，參照文獻(xiàn)《蜱的系統(tǒng)分類學(xué)》對蜱樣的盾板、假頭、氣門板、肛側(cè)板、腹面、背面等進(jìn)行對比觀察。

1.2.3 蜱蟲總DNA提取

將經(jīng)過振蕩漂洗的蜱樣轉(zhuǎn)移至RNase-free的1.5 mL離心管，使用滅菌的眼科剪刀充分剪碎，按照血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒說明書上的操作步驟提取蜱樣的總DNA。

1.2.4 蜱蟲分子生物學(xué)鑒定

采用所設(shè)計的16S rDNA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）：2×PCR Mix 12.5μL、10 mmol/L上游引物0.5μL、10 mmol/L下游引物0.5μL、cDNA 1.5μL、ddH2O 10μL，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃5 min，92℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，38個循環(huán)；72℃8 min。

反應(yīng)結(jié)束后，取2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察結(jié)果并拍照記錄，鑒定正確的PCR產(chǎn)物，回收后送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 序列分析及16SrDNA遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建

應(yīng)用序列分析軟件DNAStar對測序結(jié)果進(jìn)行拼接處理，將所得序列與GenBank中公布的蜱蟲16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，采用Mega 7.0軟件的Neighbour-Joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果（見圖1、圖2）

由圖1可知，雌蜱盾板橢圓多角形，寬度小于長度；大刻點稀少，中小刻點數(shù)量不等；頸溝深長，延伸至盾板側(cè)緣；氣門板呈逗點形。

圖1 雌蜱外部形態(tài)Fig.1 External morphology of female ticks

由圖2可知，雄蜱盾板卵圓形，全覆蓋；大刻點稀少，中小刻點數(shù)量不等；頸溝深長，超過盾板中部；氣門板呈曲頸瓶形。

圖2 雄蜱外部形態(tài)Fig.2 External morphology of male ticks

2.2 分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 線粒體16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果（見圖3）

圖3 線粒體16S rDNA PCR電泳Fig.3 16S rDNA PCR electrophoresis of mitochondrion

由圖3可知，采用蜱種鑒定的特異性引物對提取的總DNA樣品進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，在460 bp處有一目的條帶，與預(yù)期片段大小相符。

2.2.2 線粒體16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析（見圖4）

由圖4可知，采集蜱蟲為亞洲璃眼蜱，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的亞洲璃眼蜱線粒體16S rDNA的序列，應(yīng)用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)檢測樣本的線粒體16S rDNA基因序列與已知的新疆亞洲璃眼蜱處在同一分支上，可以很好地聚類。

圖4 蜱種基于16S rDNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene

3 討論

蜱作為一種重要的吸血性體外寄生蟲，其叮咬不僅可以直接造成動物損傷，而且蜱發(fā)育過程中的卵、幼蜱、若蜱和成蜱4個階段均可攜帶多種病原，是多種自然疫源性疾病的傳播媒介及貯存宿主。目前，已經(jīng)明確通過蜱蟲傳播的疾病主要包括萊姆病、森林腦炎、新疆出血熱、土拉弗氏菌病、立克次體病、蜱媒回歸熱、發(fā)熱伴血小板減少綜合征、布氏桿菌病、西尼羅河熱、漢坦病毒肺綜合征以及泰勒蟲、巴貝斯蟲等原蟲病。近年來，國內(nèi)外不斷有新的蜱傳疫病發(fā)生。其中，新疆周邊發(fā)生的蜱傳疫病主要為烏茲別克斯坦的“Karshi”病毒病[14]、俄羅斯新西伯利亞地區(qū)的克麥羅沃病毒病[15]以及與新疆南疆毗鄰吉爾吉斯斯坦的Burana病毒病[16]。

蜱傳疫病與特定的蜱種有關(guān)，而蜱種分布與地理緯度有關(guān)。開展特定地區(qū)的蜱種分布研究可豐富當(dāng)?shù)仳鐐饕咔榈牟牧希€可以對比研究同一緯度的國內(nèi)外其他地區(qū)在蜱帶病原種類和疫病流行方面的相似性和差異性。

新疆地域遼闊，約占全國總面積的1/6；陸地邊境線超過5 600 km，約占全國陸地邊境線的1/4，是中國面積最大、陸地邊境線最長、毗鄰國家最多的省區(qū)。新疆境內(nèi)地貌景觀復(fù)雜多樣，“三山夾兩盆”的獨特地形特點使得新疆出現(xiàn)交錯分布的地貌景觀；其中，南疆地區(qū)既有沙漠又有局部綠洲，適宜的氣候、植被和土壤條件為蜱蟲生長提供了良好的寄主環(huán)境。長期以來，受不同環(huán)境因素的影響，來自不同地域和不同生態(tài)環(huán)境中的蜱種往往存在遺傳變異的特點。

前期試驗的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆南疆地區(qū)的優(yōu)勢蜱種主要是圖蘭扇頭蜱，也有其他蜱種呈現(xiàn)季節(jié)性分布[17]。本研究對采自新疆和田地區(qū)昆玉市駱駝體表的蜱蟲進(jìn)行了形態(tài)學(xué)以及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，采集的蜱樣全部為亞洲璃眼蜱。16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，和田地區(qū)駱駝體表寄生的璃眼蜱與新疆南疆地區(qū)尉犁縣采集的亞洲璃眼蜱親緣關(guān)系較近，與北疆石河子、福海以及疆外內(nèi)蒙古鑒定株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，初步呈現(xiàn)出地域差異的進(jìn)化規(guī)律性。前期試驗研究表明，圖蘭扇頭蜱具有區(qū)域進(jìn)化的分子多樣性[17-18]。亞洲璃眼蜱是否也具有同一規(guī)律性，尚需要收集更多地區(qū)的材料加以證實。

4 結(jié)論

昆玉市駱駝體表寄生的蜱蟲為亞洲璃眼蜱，該蜱種呈現(xiàn)地域差異的進(jìn)化規(guī)律性。