誘導多能干細胞向肝臟細胞分化的研究進展

陳金梅 姚婷 陳小華

2007年，Yamanaka團隊通過四種轉錄因子(Oc4、Sox2、Klf4和c-Myc)將人類真皮成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞(iPSC)，從而開啟了一個醫學和生物科學技術領域的新時代。iPSC具備干細胞的自我更新和多能分化特征，在一定條件下可以分化成多種細胞譜系，重現細胞發育的生物信息，反映人類疾病的發生發展進程，用來預測藥物對人體的靶器官毒性和作用機制，在藥物篩選方面具有廣泛的應用前景。2009年，Song等通過模擬人體的肝臟胚胎發育過程，首次將人誘導多功能干細胞定向誘導分化為肝細胞樣細胞(HLC)，并且在肝細胞標志物和功能的表達上與hESC來源肝細胞相當[1]。在小鼠模型中，hiHEP具有在體內整合到肝實質的能力，使其成為再生醫學的潛在來源[2]。

iPSC可從成體細胞直接誘導而成，避免破壞胚胎所引起的倫理問題，完全不受來源限制，同時iPSC具有與其來源相同的遺傳背景，極大地解決了免疫排斥問題。但干細胞來源的肝細胞分化效率低、誘導過程復雜、費用昂貴、致瘤性及免疫原性，極大地限制了其在臨床和科研實踐中的應用。

一、分化方案

(一)外源誘導劑 總體上，分化原則是模擬肝臟的胚胎發育，使細胞分化遵循自然發展途徑。最初是以時間依賴的方式使用不同的生長因子作為調控細胞生長的發育信號，如激活素-A、成纖維細胞生長因子(FGFs)、骨形態發生蛋白(BMP)、肝細胞生長因子(HGF)和腫瘤抑制素-M(OSM)等，但分化而來的細胞通常表達不成熟的肝臟細胞表型(即表達早期標志物以及低水平的成熟肝臟細胞標志物和細胞色素P450活性[3])。

干細胞的肝臟分化主要分成三個階段：定形內胚層、肝祖細胞形成、類肝細胞成熟。干細胞的多能狀態由TGF-β/Activin/Nodal和FGF信號通路維持。一方面FGF和Activin A刺激PI3-K /GSK3β信號上調多能基因NANOG的表達，維持iPSC的未分化狀態[4]。另一方面激活素-A與nodal受體結合，模擬nodal信號誘導內胚層分化[5]。體外實驗中，在BMP4和其他PI3K抑制劑的輔助下，高劑量的激活素A能夠抑制多能基因的表達并成為內胚層分化的誘導信號[6]。同時，有研究者發現在激活素存在的情況下，內胚層可以繼續發育為肝祖細胞[5]。BMP與激活素A同是TGF-β家族成員，在胚胎發育，細胞增殖和分化中起著重要的作用[7]。其中BMP4、BMP10是分化中常用的細胞因子，以Smad和MAPK信號途徑介導中胚層和內胚層的產生[8]。肝譜系成熟通常使用HGF和OSM，前者在體內由非實質細胞產生，是促進肝再生的重要因子[9]。而OSM通過激活STAT3信號促進肝細胞的發育成熟[10]。

生長因子價格昂貴，在一定程度上限制了大規模誘導的開展。一些相對低價且有效的小分子物質(SMs)引起人們的關注。糖原合成酶激酶(GSK)-3抑制劑CHIR99021、磷酸肌醇3-激酶(PI3Ks)抑制劑LY294002、HGF受體激動劑N-己酰基-Ile-(6)氨基己酰胺和CYP3A誘導劑(地塞米松)分別被用于定形內胚層分化、肝祖細胞形成和肝細胞成熟。有學者通過SMs成功分化出hiHEPs，并且hiHEPs在總體基因和肝標志物表達方面與生長因子分化的肝臟細胞相似[11]。與其他方法相比，基于小分子的肝臟細胞分化方案具有簡單、穩定、安全和可重復性的優勢。

(二)培養條件 隨著對肝臟分化的研究不斷深入，有學者將干細胞與非實質細胞(內皮細胞、成纖維細胞)共同培養產生表型上更接近成人的肝臟細胞[12, 13]。嘗試使用不同的天然或合成的支架維持細胞分化的三維空間結構，肝臟細胞可在該結構中誘導生長，同時可再現真實的細胞外基質條件，促進營養物質、氧氣和其他因素的輸送。目前已經開發了多種可降解生物相容性支架材料，包括天然(膠原蛋白、明膠、等)、合成(聚乳酸、聚乙二醇和聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)等)材料[14]。一些納米材料，包括水凝膠纖維[15]、3D可灌注芯片系統[16]、石墨烯基3D支架[14]、電紡納米纖維[17]等因其優越的理化性質(孔徑、硬度、彈性、導電性)也被用作細胞的支架，最大程度地降低對細胞的潛在危害。細胞外基質成分是理想的支架材料，肝臟脫細胞生物支架的出現保留了完整的血管網絡和天然的細胞外基質[18]，比人工合成的支架有更大的優勢，為組織工程肝臟的研究帶來新的方向。

肝臟組織工程研究日新月異，細胞和支架的結合開啟了將多種器官特異性細胞類型整合到單一結構器官的時代，重現人類肝臟的生理和微觀解剖結構，即所謂的類器官。2001年Michalopoulos等采用成年大鼠的肝臟細胞經膠原酶分離后維持在肝細胞培養基與生長因子中，經歷一系列復雜的變化后，最終產生具有膽管上皮細胞、肝細胞和內皮細胞的組織結構[19]。Takebe等利用iPSC來源肝細胞與人臍靜脈內皮細胞和人間充質干細胞在基質膠涂板層上共培養，產生最初的iPSC源性肝細胞類器官[20]。Guan利用iPSC產生具有肝膽結構的肝類器官[21]。比起傳統的2D培養，肝臟類器官增加了體外肝臟培養系統的復雜性，彌補體外細胞培養和真實組織之間的差距，并可長期擴增、冷凍保存。更為重要的是，在動物試驗中類器官實現了血液循環和功能表達的統一。

三、應用前景

雖然iPSC具體的誘導分化方案依據實驗目的或者條件有所不同，但其終極目標都是產生具備相應結構和功能的肝臟細胞并應用于臨床，以探索疾病的發病機制及潛在的治療方案(圖1)。

圖1 hiHEP的分化過程及應用

(一)藥理學研究 hiHEP具有細胞色素P450活性，適用于研究藥物代謝和藥物毒性檢測。一方面，由于iPSC的遺傳特異性，hiHEP可以研究肝臟藥物代謝能力和藥物反應個體間差異[22]。另一方面，hiHEP評估藥物對肝細胞形態和生存能力的影響，在進入臨床試驗之前可發現潛在的肝毒性，從而提高藥物開發效率[23]。

(二)細胞治療 肝細胞移植是目前終末期肝病的有效治療手段，但肝細胞來源有限、分離細胞質量差和免疫排斥反應限制了它的應用。在再生醫學領域，有研究人員已提出使用來源于hPSC的細胞再生替代受損組織，以實現功能恢復。hiPSCs尤其具有產生分化的患者特異性細胞、允許自體細胞移植以及理論上減少免疫排斥風險的重要優勢。2014年對一名患有滲出性年齡相關性黃斑變性(AMD)的日本婦女進行了第一次基于iPSC細胞療法的人體臨床試驗，該患者右眼被植入了視網膜色素上皮細胞(RPE)片，術后1年右眼的最佳矯正視力在沒有接受常規治療的情況下未改善也沒有惡化，且2年內沒有發生免疫排斥等嚴重不良反應[24]。2018年，程剛等利用hiHEP治療肝纖維化大鼠，移植后4周大鼠肝損傷程度及肝功能有明顯改善[25]。最近的臨床前研究表明，hiHEP移植也改善了遺傳性肝病和ALF的預后[26, 27]。隨著基因組編輯技術的發展，人們通過使用核酸酶和成簇的有規律間隔的CRISPR/Cas系統對目標基因進行修飾和校正，而iPSC技術和基因編輯技術聯合應用為一些單基因遺傳代謝性肝病的“基因矯正”提供了希望[21, 28]。

(三) 體外疾病模型 疾病建模是另一個重要的生物醫學應用。來源于不同患者的特異性iPSC分化為功能成熟的肝臟細胞，可構建遺傳性肝病模型，如AAT病[29]、家族性高膽固醇血癥[30]、糖原貯積病1a型[31]、Wilson病(ATP7B缺乏)[32]、家族性甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性[33]等，模擬疾病的病理過程，為藥物研發尋找新的思路。

hiHEP也廣泛應用于嗜肝病毒感染中。使用人類多能干細胞誘導分化HLC，能夠表達肝細胞標記物和對乙肝病毒(HBV)感染重要的宿主因子，再現病毒的生命周期和病毒誘導的肝功能障礙[34-36]。hiHEP同樣表達已知的參與丙肝病毒(HCV)進入的丙肝病毒宿主受體(Claudin-1、Occludin、SR-BI、CD81)，并支持丙肝病毒基因型2a長達21天的完整生命周期[37]。戊肝病毒(HEV)[38]、寨卡病毒(ZIKV)[39]感染的肝臟模型也已經開發出來。同時來自不同供體的iPSC是個體化肝炎研究與治療的可靠模型。經脂肪酸處理過的hiHEP可以誘導出非酒精性脂肪肝表型，從而鑒定肝脂肪變性相關的肝標記物和調節通路[40]。

四、總結與展望

盡管iPSC為肝臟疾病帶來了新曙光，但目前的分化方案衍生出的HLC仍然與人類成熟肝細胞有一定差距。同時iPSCs中檢測到的基因組易位將產生融合蛋白和新的免疫原性決定簇，直接或間接促進體內免疫原性和致瘤性，引發安全問題[41]。盡管種種限制，我們仍需要竭盡全力尋找新的方案，將干細胞分化為具有表型穩定性且無致瘤風險的功能性和可移植性細胞。相信隨著分化技術及材料的進一步發展與成熟，hiHEP勢必將在臨床應用上取得更大的突破。