肝細胞癌組織中Glypican-3表達與腫瘤生物學行為的關系

常麗仙 劉春云 謝翩

肝細胞癌術后較高的復發、轉移率一直是影響遠期療效的關鍵因素，故早期預測肝細胞癌術后復發轉移風險，并制定出合理的干預手段，對改善患者遠期預后意義重大[1]。早發現、早診斷為原發性肝細胞癌早干預的關鍵，但諸多患者就診時已延誤了治療最佳時機，且肝細胞癌侵襲性高，預后較差，故研究肝細胞癌的發病機制，找到幫助臨床早期診斷的標志性生物學指標迫在眉睫[2-3]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3(phosphatidylinositol proteoglycan 3，GPC3)是乙酰肝素硫酸蛋白聚糖家族一員，在人類胚胎中廣泛表達，GPC3可通過骨形態發生蛋白、胰島素生長因子等調控胚胎生長、形態改變[4-5]。本研究通過觀察肝細胞癌組織中GPC3表達與肝細胞癌惡性生物學行為之間的關系，已期指導早期診斷與治療。

資料與方法

一、納入對象與基線資料

回顧性分析2017年12月至2020年8月昆明市第三人民醫院就診的77例肝細胞癌患者的臨床資料，其中男性55例，女性22例；年齡為(36.6±5.1)歲。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期42例；淋巴結轉移42例；病灶直徑<5 cm 38例，≥5 cm 39例。肝功能Child-Pugh[5]評級：A級40例，B級37例。納入條件：①診斷符合《肝細胞癌外科治療方法的選擇專家共識(2016年第3次修訂)》[6]中相關標準；②患者均經臨床病理確診為肝細胞癌；③預計生存時間超過半年；④患者臨床資料無缺失。排除條件：①術前接受放化療；②合并活動性感染且抗感染效果不理想；③凝血功能異常；④伴血液性疾病患者；⑤因藥物引起脂肪肝、酒精性肝病等肝病者；⑧合并其他部位惡病質者。本研究涉及的有關倫理問題均按照倫理委員會規定，且均取得患者及家屬的同意。

二、標本采集

肝細胞癌標本取自于肝細胞癌原發病灶處，癌旁組織取自于距離原發病灶5 cm的癌旁肝組織，正常肝組織取自于距離肝細胞癌原發病灶5 cm外的肝組織，且經病理學檢查為正常肝組織。所有組織來源均在術中離體30 min內完成取材，在此過程中應用的醫療器械、標本管均經去RNA酶水浸泡后使用。

三、 方法

(一)儀器及試劑 兔抗人Ebpl單克隆抗體(美國abeam公司)、鼠抗人GPC-3單克隆抗體(北京中杉生物技術有限公司)、免疫組化試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)、DAB顯色試劑盒(福州巧新生物技術公司)、PBS緩沖液粉劑(北京中杉生物技術有限公司)、枸櫞酸緩沖液粉劑(北京中杉生物技術有限公司)、RM2255全自動切片機(德國leica公司)、單道微量可調節加樣器(Biohit芬蘭百得公司)、D21-CB圖像采集系統(日本OLYMPUS公司)、切片沖洗烘溫控儀(安徽儀器有限公司)。

(二)免疫組化染色結果判定標準 參照張晶晶等[7]的免疫組織化學結果判定標準，胞質內黃色顆粒為陽性細胞。采用半定量計分法判斷，隨機選取5個高倍鏡視野，0分：視野內陽性細胞≤5%(陰性)，1分：6%～25%(陰性)，2分：26%～50%(弱陽性)，3分：51%～75%(陽性)，4分：≥76%(強陽性)。染色顆粒顏色：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終得分=細胞內染色強度分值*細胞陽性率分值。

(三)癌細胞惡性生物學行為 采用熒光定量PCR檢測組織中與增殖、侵襲及自噬基因相關生物學指標的表達。增殖基因包括：沉默信息調節因子6(silent information regulator 6，SIRT6)、叉頭框P2(fork head box P2，FOXP2)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1 α，HIF-1α)。肝細胞凋亡相關因子包括：磷脂肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteine containing aspartate proteolytic enzyme 3，caspase-3)、絲蘇氨酸蛋白激酶(serine threonine protein kinase，Akt)。細胞吸光度值、細胞增殖及遷移細胞數量均參照文獻[8]。

四、統計學方法

結 果

一、 各組織中GPC3的表達情況

肝細胞癌組織中GPC3陽性表達率為98.70%(76/77)，癌旁組織89.61%(69/77)，正常組織為2.60%(2/77)，各組織中GPC3陽性表達臨床比較，差異有統計學意義(χ2=275.074，P<0.01)，其中正常肝組織GPC3陽性表達率低于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=10.421，P=0.004)；正常肝組織GPC3陽性表達率低于肝細胞癌組織，差異有統計學意義(χ2=11.645，P<0.01)；見表1。各組織中S100A2表達分級比較差異有統計學意義(Z=6.839，P<0.01)。

表1 77例肝細胞癌患者各組織中GPC3的表達情況[份(%)]

二、不同組織中癌細胞惡性生物學指標與組織中GPC3表達情況

與癌旁組織相比，肝細胞癌組織中GPC3分值、FOXP2、HIF-1α、SIRT6、PI3K、caspase-3、Akt表達均較高，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表2。

表2 77例肝細胞癌患者不同組織中癌細胞惡性生物學指標與GPC3表達情況(±s)

三、肝細胞癌組織中GPC3表達與癌細胞惡性生物學行為相關基因的相關性

經雙變量Pearson直線相關性檢驗結果顯示，肝細胞癌組織中GPC3表達與癌細胞惡性生物學行為(增殖基因：SIRT6、FOXP、HIF-1α；肝細胞凋亡相關因子：PI3K、caspase-3、Akt)表達均呈正相關(r>0，均P<0.05)。見表3。

表3 肝細胞癌組織中GPC3表達與癌細胞惡性生物學行為相關基因的相關性

討 論

肝細胞癌是臨床惡性程度較高的消化系統腫瘤之一，即便臨床現階段各種放化療的手段不斷更新、完善，肝細胞癌的病死率仍居高不下。

現階段臨床針對肝細胞癌的診斷還局限于血清甲胎蛋白的表達，但針對肝細胞癌的研究，已經從單一、多種血清聯合診斷逐漸向肝細胞癌體外生長機制與功能的擴展，聯合多種生物學指標的診斷在提高肝細胞癌早期檢出率與準確度方面是必然趨勢[9]。硫酸乙酰肝素蛋白多糖是一類蛋白，具有單條或多條疏酸乙酸肝素鏈，GPC3蛋白是硫酸乙酰肝素類蛋白聚糖眾多成員中的一員，不同時期，其在機體內的分布存在顯著差異，胎兒時期GPC3主要表達于肝臟，成年時期在乳腺、胎盤、卵巢、腎臟、肺臟中弱表達，但在肝臟及其他組織中幾乎不表達，且成人時期GPC3表達與惡病質的發展密切相關，如卵巢癌、乳腺癌中表達缺失，但在肝癌中呈高表達[10-11]。GPC3是由核心蛋白與糖胺聚糖組成，能夠與肝素結合型蛋白結合，并介導細胞的生長、增殖。GPC3介導肝細胞癌發生的機制：①GPC3定位在細胞膜上，與Wnt黏附、結合，形成復合物，提高Wnt表達，提高Wnt信號傳導通路的活躍度的同時，提高相關癌基因表達，導致癌細胞增生，誘發致癌；②通過N末端脯氨酸豐富區與胰島素樣生長因子及其受體結合，減少細胞外信號調節激酶的磷酸化，導致肝癌發生[12-13]。本研究通過對比不同肝組織中GPC3表達情況，結果顯示，正常肝組織GPC3陽性表達率低于癌旁組織和肝細胞癌組織。提示肝組織GPC3在肝細胞癌中呈高表達，由此考慮肝組織GPC3的表達是否與肝細胞癌的病程進展存在某種聯系，目前現有的研究結論尚不可知。

本研究通過進一步分析肝組織GPC3表達與癌細胞惡性生物學行為之間的關系，結果顯示，與癌旁組織相比，肝細胞癌組織中GPC3分值、FOXP2、HIF-1α、SIRT6、PI3K、caspase-3、Akt表達均較高。各類惡病質細胞的惡性增殖、凋亡均受相關基因表達的影響，而相關基因的表達又可間接反應惡病質的程度，基因的改變可影響癌細胞的增殖、凋亡，使得細胞凋亡受阻，病程延長[14]。FOXP2可通過介導AKT信號通路來抑制肝細胞增殖，HIF-1α增強癌細胞缺氧耐受力；SIRT6是參與細胞周期促進細胞生長的重要指標[15]。本研究結果顯示，肝細胞癌組織中GPC3表達與SIRT6、FOXP、HIF-1α、PI3K、caspase-3、Akt表達均呈正相關。其原因可能為：①GPC3可抑制成纖維細胞生長，降低肝癌細胞與纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白的黏附作用，提高細胞侵襲與遷移能力；②GPC3激活與肝癌細胞增殖、侵襲密切相關的整合素信號通道，激活下游轉錄因子，促進肝癌細胞生長；③結合胰島素生長因子Ⅱ，促進肝細胞持續增殖，加速細胞惡變[16-17]。因本研究為回顧性分析，在選取癌細胞增殖、凋亡基因時，只選取了部分基因，結果存在片面性，希在未來開展更多前瞻性、大樣本的研究加以驗證。