高效液相色譜法測定杞菊地黃制劑中毛蕊花糖苷含量

南榮華 ，吳 芳 ，康小風 ，黃 艷 ，李 翠 ，2，戴 涌 ，2△

（1. 陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065； 2. 國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢驗技術(shù)重點實驗室，陜西 西安 710065）

杞菊地黃制劑主要由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等中藥材經(jīng)提取加工制成，用于治療肝腎陰虧、頭暈耳鳴、明畏光、迎風流淚、視物昏花［1］。熟地黃采取酒燉蒸煮的炮制方法，藥性微溫，味道甘甜，有益精填髓、補血滋陰功效。熟地黃富含氨基酸、地黃素、糖類、梓醇等多種微量元素［2］，具有抗衰老、抗氧化、促進造血、增強免疫力的藥理學作用［3-5］。毛蕊花糖苷為常用于熟地黃質(zhì)量評價的指標性成分，但2020 年版《中國藥典（一部）》僅對杞菊地黃制劑中芍藥苷、馬錢苷進行含量測定［6-7］。本研究中建立了測定杞菊地黃制劑（片劑和口服液）中毛蕊花糖苷含量的高效液相色譜法，為系統(tǒng)評價其質(zhì)量提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有G7115A型紫外檢測器、Waters Empower工作站；P211D 型分析天平（精度為0.01/ 0.1 mg），BS224S 型分析天平（精度為0.000 1 mg），均購自德國賽多利斯公司；HH - S8A 型恒溫水浴鍋（北京科偉公司）；UPH - 11 - 10T 型超純水機（優(yōu)普科技股份有限公司）。

1.2 試藥

毛蕊花糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111530 - 201411，含量為94.4%）；杞菊地黃制劑（2018 年國家評價性抽驗樣品）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido Spolar C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 - 0.1%甲酸溶液（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：330 nm；進樣量：10 μL。理論板數(shù)以毛蕊花糖苷峰計應(yīng)不低于4 000。

2.2 溶液制備

取毛蕊花糖苷對照品7.18 mg，精密稱定，加甲醇定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，精密量取2 mL，定容至10 mL 容量瓶中，即得每1 mL 含毛蕊花糖苷14.36 μg的對照品溶液。精密量取杞菊地黃口服液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得口服液供試品溶液。取杞菊地黃片，除去包衣，研磨均勻，取3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，于80 ℃水浴加熱30 min［6］，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得片劑供試品溶液。按處方工藝制備不含熟地黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：吸取 2.2 項下 5 種溶液各 10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.VerbascosideA.Reference solution B-C.Test solution（oral liquid and tablets，respectively） D- E.Negative reference solution（oral liquid and tablets，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：考察口服液時，精密吸取質(zhì)量濃度為14.36 μg/ mL 的對照品溶液1，2，4，6，8，10，15 μL；考察片劑時，精密吸取質(zhì)量濃度為71.8 μg/mL 的對照品溶液1，2，4，6，8，10，15，20 μL，分別按2.1 項下色譜條件進樣測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y口= 1.22 ×106X口+ 1 730（r= 0.999 0，n= 7）和Y片= 1.21 ×106X片+60 200（r=0.995 0，n=8）。結(jié)果表明，口服液和片劑中毛蕊花糖苷的進樣量分別在0.013 6～0.203 4 μg和0.067 8～1.355 7 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為14.36 μg/mL）10 μL，按2.1項下色譜條件重復進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取2.2 項下供試品溶液（口服液、片劑）各 20 μL，分別于0，4，8，12，16，20，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果口服液和片劑的RSD分別為1.12%和1.27%（n= 7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：精密量取同一批口服液，取同一批片劑，精密稱定，分別依法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算含量。結(jié)果口服液和片劑中毛蕊花糖苷的平均含量分別為10.90 μg/mL 和113.74 μg/ g，RSD分別為0.99%和1.94%（n= 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：考察口服液時，精密量取已知含量的供試品溶液（含毛蕊花糖苷10.90 μg/ mL）6 份，各3 mL，置10 mL容量瓶中；考察片劑時，取已知含量的供試品溶液（含毛蕊花糖苷113.74 μg/ g）6 份，各1.5 g，精密稱定，分別精密加入質(zhì)量濃度為35.9 μg/mL 的毛蕊花糖苷對照品溶液1 mL 和5 mL，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 毛蕊花糖苷加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery test of verbascoside（n=6）

耐用性試驗：分別采用不同品牌及型號的高效液相色譜儀（島津2030C-3D型、Agilent 1260 Infinity Ⅱ型），以及不同品牌的色譜柱［Agilent 5TC - C18柱、Shiseido Spolar C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）］，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果樣品中的待測定峰均分離完全，表明方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

共抽取4 個省份、8 家不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品（65 批口服液、5批片劑），按2.1項下色譜條件進樣測定，計算毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果5批片劑中毛蕊花糖苷的含量為0.11～0.27 mg/ g，平均為0.22 mg/ g；口服液中含量測定結(jié)果見表2。可見，不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品中毛蕊花糖苷含量有不同程度的差異，部分生產(chǎn)企業(yè)含量高，但集散程度較大，產(chǎn)品批間差異大，說明該生產(chǎn)企業(yè)在原料藥和生產(chǎn)工藝的控制方面的水平不穩(wěn)定。

表2 8家生產(chǎn)企業(yè)的杞菊地黃口服液中毛蕊花糖苷含量測定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of verbascoside in Qiju Dihuang Oral Liquid of eight manufacturing enterprises

3 討論

3.1 提取條件選擇

在供試品溶液的制備中分別以乙醇、50%甲醇、甲醇為溶劑，結(jié)果以甲醇為溶劑時測定的含量最高；考察了片劑加熱回流提取及超聲提取2種提取方法，結(jié)果采用加熱回流提取時測定的含量最高。

3.2 色譜條件選擇［8-15］

以甲醇（乙腈）-水、甲醇（乙腈）-0.1%甲酸按一定比例混合作為流動相，結(jié)果以乙腈-0.1%甲酸溶液（15∶85，V/V）為流動相時雜質(zhì)峰較少，基線平穩(wěn)，分離度較好；在其余條件不改變的前提下，改變柱溫（25，30，35，40 ℃），結(jié)果柱溫為30 ℃時目標峰與相鄰峰間分離度最佳。故最終確定2.1 項下色譜條件，供試品溶液的峰形較好，分離度符合要求。

3.3 指標性成分選擇

熟地黃為玄參科植物地黃的炮制加工品，味甘，微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有填精補腎、滋養(yǎng)陰血功效，通過配伍可實現(xiàn)真精與氣、血、陰、陽的互化，視為五臟六腑之藥，熟地黃及其活性成分在血液、內(nèi)分泌、心血管、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)均有廣泛的藥理學作用［16-17］，在杞菊地黃制劑中為處方量最大的一味藥。取生地黃藥材，照《中國藥典》方法自行炮制熟地黃，分析炮制過程中不同階段地黃的含量，結(jié)果毛蕊花糖苷的含量在炮制過程中并未發(fā)生明顯變化，故其可作為評價熟地黃飲片及含熟地黃成分的制劑質(zhì)量優(yōu)劣的指標性成分之一。

3.4 方法評價

本方法操作簡單，結(jié)果準確，重復性好，可用于測定杞菊地黃制劑中毛蕊花糖苷的含量。