熟地黃高壓炮制工藝研究*

陳子月 ，彭小園 ，解偉松 ，孫雙龍 ，劉興超 ，4，肖學(xué)鳳 △

（1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617； 2. 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200； 3. 河北仁心藥業(yè)有限公司，河北 保定 071200； 4. 河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050200）

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根［1］，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。常用入藥形式有鮮地黃、生地黃、熟地黃、生地炭、熟地炭等，不同炮制品的性味、功效不同。鮮地黃性寒，味甘苦，清熱生津、涼血止血；生地黃性寒，清熱涼血、養(yǎng)陰生津；熟地黃性溫，補(bǔ)血滋陰、益精填髓［2］。地黃炮制方法在古代有蒸制、熬制、醋炒制等，現(xiàn)代炮制方法主要有生用、酒炒制、炭炒制等［3-4］。《中國(guó)藥典（一部）》《全國(guó)中藥材炮制規(guī)范》及各省市中藥材炮制規(guī)范中，熟地黃的現(xiàn)代制法各異，甚至簡(jiǎn)化為一次性蒸制或酒燉，但炮制時(shí)間均過(guò)長(zhǎng)［5-8］。研究發(fā)現(xiàn)，炮制時(shí)間與次數(shù)對(duì)熟地黃的活性成分含量的影響較大［9］。地黃中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、呋喃醛衍生物等化合物［10-11］。本研究中以地黃代表性成分梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷和5 - 羥甲基糠醛（5 - HMF）為指標(biāo)性成分，探討了熟地黃的最佳炮制工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；ME204E102 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；YX - 280D 型手提式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；KQ - 300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；Mili-Q型純水/超純水系統(tǒng)（美國(guó)Milipore公司）。

1.2 試藥

懷地黃（安國(guó)市祁利堂中藥材銷售有限公司，批號(hào)為20200316），經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭開顏副教授鑒定為正品；梓醇對(duì)照品（批號(hào)為AF9030401），毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)為 AF20110904），5 - HMF 對(duì)照品（批號(hào)為AF9052005），純度均不低于98%，均購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司；地黃苷D 對(duì)照品（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)為7534，純度不低于98%）；甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil?C18-WR柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水溶液（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Catalpol 2.5 - HMF 3.Rehmannioside D 4.VerbascosideA - B.Test solution（Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata） C.Mixed control solutionFig.1 HPLC chromatograms

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase（%）

2.1.2 溶液制備

取懷地黃/ 熟地黃粗粉0.1 g，精密稱定，加25 mL 50%甲醇溶解，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。分別取梓醇、5-HMF、地黃苷D、毛蕊花糖苷對(duì)照品4.44，4.40，6.02，3.49 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇 - 水溶液（50∶50，V/V）定容，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）至完全溶解，配制成上述4種成分質(zhì)量濃度分別為0.444，0.440，0.602，0.349 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別吸取2，6，10，14，18 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇 -水溶液（50∶50，V/V）定容，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各成分的質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=5）Tab.2 Results of linear relationship test（n=5）

精密度試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄各對(duì)照品的峰面積。結(jié)果梓醇、5-HMF、地黃苷D、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為0.20%，0.29%，0.09%，0.34%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液20 μL，分別于0，3，6，9，12 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果梓醇、5 - HMF、地黃苷D和毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.40%，1.60%，0.46%，0.62%（n= 5），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，共6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果梓醇、5-HMF、地黃苷D、毛蕊花糖苷含量的RSD分別為0.35%，0.79%，0.95%，1.86%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品0.1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，取10 mL，共6 份；分別取梓醇、5 - HMF、地黃苷D、毛蕊花糖苷對(duì)照品0.171，0.205，0.333，0.306 mg，精密稱定，加入每份供試品溶液中，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）使完全溶解，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

環(huán)保型水利工程的建設(shè)可減少空氣污染。在施工過(guò)程中，需要減少施工現(xiàn)場(chǎng)的煙塵，減少?gòu)U氣中有害氣體的排放。進(jìn)行材料運(yùn)輸時(shí)，需要采用封閉性較好的運(yùn)輸車，同時(shí)使用灑水車進(jìn)行輔助，從而減少粉塵污染。使用工程機(jī)械時(shí)，需要安裝除煙塵裝置。對(duì)于廢水以及廢棄物對(duì)環(huán)境的污染問(wèn)題，需要嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制，可對(duì)廢水和廢棄物進(jìn)行處理后回收利用，對(duì)于不可回收的材料，需要嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行處理，嚴(yán)禁隨意丟棄，如重金屬材料。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery test（n=6）

2.1.4 樣品含量測(cè)定

取各蒸制時(shí)間段的樣品適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3 次，記錄峰面積，并計(jì)算各蒸制時(shí)間段4 個(gè)成分的含量。結(jié)果見表4和表5。

表4 120 ℃條件下地黃一次蒸制各成分含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.4 Determination results of various ingredients content in Rehmanniae Radix first steaming at 120 ℃（%，n=3）

表5 120 ℃條件下地黃二次蒸制各成分含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.5 Determination results of various ingredients content in Rehmanniae Radix second steaming at 120 ℃（%，n=3）

2.2 炮制工藝研究

采用高壓炮制熟地黃。1）高壓一次蒸制：將生懷地黃清洗干凈，置高壓鍋中，設(shè)蒸制溫度為120 ℃，分別蒸制10，15，20，25，30，35，40 min，蒸制完畢，取出，切片，晾干，用于含量測(cè)定。2）高壓二次蒸制：將生懷地黃清洗干凈，置高壓鍋中，設(shè)蒸制溫度為120 ℃，先蒸制10 min，然后加入40%的水燜潤(rùn)4 h，再分別蒸制10，20，30，40 min，蒸制完畢，取出，切片，晾干，用于含量測(cè)定。

含量測(cè)定結(jié)果：高壓一次蒸制和高壓二次蒸制各成分含量變化見表4 和表5。可見，2 次蒸制梓醇、地黃苷D和毛蕊花糖苷的含量都隨蒸制時(shí)間的增加而降低，而5-HMF的含量隨蒸制時(shí)間的增加而升高。梓醇的含量在蒸制過(guò)程中下降很快，毛蕊花糖苷的含量也下降較快，而地黃苷D的含量在炮制過(guò)程中雖有下降，但下降幅度不高。一次蒸制40 min時(shí)，梓醇含量為0，5-HMF、地黃苷D 和毛蕊花糖苷的含量分別為0.37%，0.67%，0.14%；二次蒸制20 min 時(shí)，梓醇含量為0，5-HMF、地黃苷D 和毛蕊花糖苷的含量分別為0.14%，0.67%，0.17%，均符合2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中熟地黃含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

外觀評(píng)價(jià)：高壓一次蒸制40 min 時(shí)，切制的熟地黃片仍不符合《中國(guó)藥典》要求；高壓二次蒸制20 min 時(shí)，切制的熟地黃均符合要求。

優(yōu)選的炮制工藝：通過(guò)分析4 種成分的含量變化和對(duì)炮制品外觀評(píng)價(jià)，優(yōu)化了熟地黃的炮制工藝，即高壓二次蒸制，將生地黃先蒸制10 min，用水或黃酒燜潤(rùn)4 h，再蒸制20 min。第1 次蒸制的目的是加快水的吸收、燜潤(rùn)完全。分別考察二次蒸制10，20，30，40 min 時(shí)炮制熟地黃成品的外觀，結(jié)果二次蒸制20 min 能完全滿足試驗(yàn)要求，達(dá)到了二次蒸制的目的。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.2 指標(biāo)成分選擇

參考2015 年版和2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中生地黃和熟地黃的檢測(cè)指標(biāo)，選取梓醇、毛蕊花糖苷和地黃苷D 作為檢測(cè)指標(biāo)。地黃炮制過(guò)程中，大多數(shù)成分含量都呈下降趨勢(shì)，而5-HMF 的含量明顯上升，故選擇5-HMF為熟地黃炮制過(guò)程變化的標(biāo)志物。

3.3 藥材產(chǎn)地差異影響炮制質(zhì)量

炮制過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)生地黃若用水或黃酒燜潤(rùn)透，進(jìn)一步蒸制所需時(shí)間就會(huì)縮短，而由于產(chǎn)地差異問(wèn)題，在燜潤(rùn)過(guò)程中，生地黃內(nèi)部存在硬芯，導(dǎo)致蒸制時(shí)間即使延長(zhǎng)也會(huì)出現(xiàn)不合格產(chǎn)品。

3.4 方法評(píng)價(jià)

二次蒸制可獲得合格的熟地黃，通過(guò)對(duì)熟地黃中指標(biāo)性成分的測(cè)定與炮制過(guò)程中成分含量變化的比較，優(yōu)化熟地黃的炮制新工藝在保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)大大縮短了炮制時(shí)間，為熟地黃的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。