重樓皂苷Ⅶ對K562細胞增殖和凋亡的作用機制研究

朱紅波，譚莉明，李彩余，周衛華

（1.山東第一醫科大學第二附屬醫院血液內科，山東泰安 271000；2.吉首大學醫學院護理教研室，湖南吉首 416000；3.湘西自治州人民醫院產前診斷中心，湖南吉首 416000）

白血病是常見的血液系統惡性腫瘤，在人類惡性腫瘤發病率中居第六位[1]。與實體瘤不同，血液系統惡性腫瘤不能通過手術或放射治療治愈，其他新興療法也難以普及，如干細胞移植存在匹配困難等問題，只能用于少部分患者[2]。因此，化療仍是白血病的主要治療方法，但其不良反應和耐藥性已成為化療的主要障礙。K562細胞系是費城（Ph）染色體陽性的多能前體細胞，最初來源于急變期末期慢性粒細胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）患者[3]；該細胞系是非貼壁的、圓形的、高度未分化的，具有活躍的增殖能力和抑制細胞凋亡的作用。研究表明，中藥中的活性成分通過誘導細胞分化和凋亡，在白血病治療中發揮顯著作用[4-6]。因此，惡性造血細胞可能對以凋亡和分化信號通路為靶向的治療特別敏感。探索新型治療藥物及其分子機制對改善CML患者的預后具有重要意義。

植物來源的化合物相對于化療、手術和放射療法具有較高成本效益，且毒性較低，并能通過不同的途徑抑制腫瘤。百合科植物重樓，又名七葉一枝花，作為一種中草藥被用于癌癥治療[7-8]。重樓抗腫瘤的主要成分是甾體皂苷。重樓皂苷Ⅶ（PP7）為重樓抗腫瘤活性物質的有效成分之一，具有較強的抗癌活性；研究證實PP7可以通過線粒體和死亡受體途徑誘導SW-480細胞凋亡并將SW-480細胞周期阻滯于G1期[9]。PP7能夠抑制PANC-1細胞增殖、遷移和侵襲，并可能通過下調PD-L1表達誘導PANC-1細胞凋亡[10]，但重樓皂苷Ⅶ在白血病中的抗腫瘤作用未見報道。本研究旨在通過PP7作用于K562細胞來探討PP7對白血病腫瘤細胞的抑制作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、實驗藥物和試劑 細胞株K562購自中國科學院上海細胞庫，傳代培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，5%CO2、37 ℃條件下培養。重樓皂苷Ⅶ（上海純優生物科技有限公司分子式C51H84O22，純度＞98 %，分子量為1 049.2）；細胞增殖活性試劑盒（CCK-8）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Annexin-Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 CCK-8檢測PP7對K562細胞增殖的影響 將呈指數生長的K562（1.3×105/mL）接種到96孔板的孔中，分別加入濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L的PP7，在空白對照孔中加入等體積的DMEM培養基作空白對照。每個濃度設5個重復，每孔總體積為100 μL。將不含PP7但具有相同濃度(＜0.1%)二甲基亞砜（DMSO）的細胞用作對照組(0 μmol/L)。細胞孵育24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8。在CO2培養箱孵育2 h，使用BioRad M450酶標儀測量450 nm波長處的光密度(A)。每個實驗重復3次，細胞增殖抑制率（CVIR）按下式計算：CVIR=（1－實驗組A450平均值/對照組A450平均值）×100%，為進一步實驗選擇最佳PP7濃度。

1.3 熒光素標記磷脂酰絲氨酸/碘化丙啶（Annexin-Ⅴ-FITC/PI）試劑盒檢測PP7對K562細胞凋亡的作用 K562細胞以1.5×105/mL的密度接種于6孔板中，并用不同濃度的PP7處理24 h，使用Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙染色通過流式細胞術測量檢測細胞凋亡情況。將細胞重懸于100 μL結合緩沖液中，加入5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI，輕輕混合，將細胞在室溫下避光孵育15 min，然后加入緩沖液500 μL。在1 h內使用BD FACSCantoII流式細胞儀進行檢測，每個實驗重復3次。

1.4 免疫印跡法（Western Blot）檢測Bax、Bcl-2和caspase-9蛋白表達改變 收取PP7處理過K562細胞并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。通過RIPA裂解緩沖液提取總細胞蛋白。并使用Bradford試劑測定蛋白質濃度。根據蛋白質電泳的常規方法制備凝膠和樣品，并將蛋白質轉移到膜上。兔抗人Caspase-9、Bcl-2、Bax和GADPH抗體（上海生工生物工程有限公司），膜孵育過夜。漂洗后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶2 000），將膜在振蕩器上孵育2 h。最后，加入化學發光試劑用于成像。

1.5 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行數據處理。計量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較行Tukey法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PP7對K562細胞增殖抑制率的影響 隨著PP7濃度的增加，K562細胞的生長逐漸減弱，PP7對細胞生長的抑制呈濃度依賴性，見表1。

表1 PP7對K562細胞增殖抑制率的影響（）

表1 PP7對K562細胞增殖抑制率的影響（）

PP7濃度(μmol/L) 細胞總抑制(%)0.5 41.32±5.03 1.0 56.03±6.01 2.0 82.36±6.12 4.0 91.34±3.01 8.0 96.73±1.89 F值 125.88 P值 0.002

2.2 PP7對K562細胞凋亡的影響 Annexin-V/PI染色法定量檢測PP7對K562細胞引起凋亡的作用。結果表明，隨著PP7濃度的增加，K562細胞凋亡的比例逐漸增加，見表2、圖1。

表2 PP7對K562細胞凋亡影響（）

表2 PP7對K562細胞凋亡影響（）

PP7濃度(μmol/L) 細胞總抑制(%)空白組 15.74±3.12 0.5 43.16±6.08 1.0 64.32±7.03 2.0 91.74±3.05 F值 357.29 P值 0.007

圖1 不同濃度PP7誘導K562細胞凋亡情況

2.3 Western blot檢測結果 通過Westernblot研究PP7處理K562細胞中凋亡相關蛋白的表達。蛋白質印跡結果顯示，各濃度的PP7都導致Caspase-9裂解的水平顯著增加，見圖2。隨著PP7濃度的增加，抑制Bcl-2表達的作用越明顯，而凋亡蛋白之一的Bax的表達顯著增加。

圖2 各濃度PP7對K562細胞蛋白表達的影響

3 討論

天然產物已被證明是抗腫瘤藥物開發的可靠來源。PP7是一種天然的皂苷衍生化合物，存在于中草藥重樓的根莖組織中[11]。PP7具有抗炎[12]、止血鎮痛[13]、免疫調節[14]等藥理作用，且不良反應小，已被廣泛應用于臨床。最近有研究顯示，PP7在各種癌細胞系中誘導細胞凋亡，并在體內具有抗腫瘤活性，如肺癌和卵巢癌[15]。PP7可通過抑制P-糖蛋白和誘導細胞凋亡來抑制化療耐藥性乳腺癌的生長并逆轉MCF-7/阿霉素耐藥細胞的多藥耐藥性。PP7降低基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9的活性，提高A549肺癌細胞中金屬蛋白酶的表達。PP7可通過p38 MAPK信號通路抑制MMP-2和MMP-9的產生來抑制遷移和侵襲。PP7可顯著抑制H460細胞增殖,影響其集落形成，并使細胞形態發生變化，抑制細胞體外的遷移和侵襲能力，并可誘導凋亡的發生。這說明PP7具有導致腫瘤細胞線粒體功能紊亂的作用，通過調節癌細胞中的幾種信號通路來誘導細胞凋亡。本研究結果表明，PP7抑制K562細胞的生長，并且該抑制作用與藥物濃度呈正相關。誘導凋亡可能是PP7抑制K562細胞生長的機制，通過該機制可以在K562細胞中發揮PP7的抗增殖活性。本研究證明K562細胞凋亡受PP7處理的影響，0.5～2 μmol/L PP7處理24 h后，K562細胞凋亡率顯著增加。

線粒體不僅是細胞內能量產生的關鍵細胞器，也是細胞信號轉導的平臺，在細胞信號轉導、細胞增殖、分化、自噬和細胞免疫中起著至關重要的作用。線粒體是動態的細胞器，其分裂和融合的不平衡導致結構變化和功能障礙。細胞內有兩種主要的凋亡途徑：外在（死亡受體途徑）和內在（線粒體途徑）。線粒體介導的內在凋亡途徑的激活受Bcl-2家族蛋白控制，是抗腫瘤藥物功能中涉及的關鍵機制之一。Bcl-2是細胞凋亡途徑中的上游效應分子，已被確定為細胞凋亡的有效抑制因子[16]。Bax/Bcl-2調節細胞色素C（Cyt C）從線粒體釋放到細胞質中，細胞質中的Cyt C啟動Caspase級聯反應（如Caspase-3/9），導致細胞凋亡[17]。PP7處理K562細胞后，Bcl-2表達明顯受到抑制，Bax表達得到促進，因此，Bax/Bcl-2顯著增加。半胱天冬酶級聯的激活也在線粒體凋亡途徑中起關鍵作用。Caspase-9是內在途徑中Caspase級聯反應的關鍵起始蛋白，本研究結果顯示，PP7以濃度依賴性方式顯著增加裂解的Caspase-9的表達。這提示用PP7處理的K562細胞是通過線粒體所調節的內在凋亡途徑而受到抑制。

綜上，本研究為PP7在抗CML細胞中抗腫瘤活性中的作用提供了實驗證據，PP7具有成為臨床治療慢性粒細胞白血病有效藥物的潛力。