PCNT基因SNP位點rs2070426多態性與食管癌的關系

喬佳欣，宋 昕，徐瑞華，趙學科，魏夢霞，王 苒，韓雪娜，陳亞杰，孫 琳，馬琳琳，謝葉真，白合林，羅 宏，李愛麗，王立東

食管癌是上消化道常見的惡性腫瘤，每年新發50萬例食管癌患者中一半以上發生在中國[1-2]，患者的死亡率排在消化系統腫瘤的第一位[3]。食管癌早期無特異性癥狀，確診時大多已達中晚期，5 a生存率僅約20%[4-7]，嚴重威脅著人們的健康。食管癌病因復雜，尚未明確。普遍認為食管癌的發生與胃部食物的反流有關[8-9]。但目前國內外的食管癌因主要發生部位不同而對食管的研究方向也不相同，導致目前對食管癌的診斷沒有明確的判斷標準。最新研究表明，PCNT SNP位點rs2070426多態性不同方向的突變表達，其對應的蛋白表達量也不同，不同的蛋白表達量食管癌患者的生存也不同，因此蛋白表達在腫瘤發生、進展和侵襲中發揮重要作用。總結得出食管癌中基因的改變與食管癌的預后有一定的相關性[10]。

以上方法的進行需要外顯子技術的參與，外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)是利用探針雜交富集外顯子區域的DNA序列，通過高通量測序，發現與蛋白質功能變異相關遺傳突變的技術手段。相比于全基因組測序，外顯子組測序深度更高，更加經濟、高效，能直接對蛋白編碼序列進行測序，找出影響蛋白結構的變異。同時，WES能高深度測序，可發現常見變異、低頻變異及罕見變異，是非常有價值的一種方法。

綜上，本研究提出以下研究目的：探究PCNT SNP位點rs2070426不同基因型患者的生存狀況，探究PCNT SNP位點rs2070426不同基因型患者的蛋白表達量。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究納入的199例患者均來自于鄭州大學第一附屬醫院省部共建食管癌防治國家重點實驗室50萬例食管癌患者臨床信息數據庫，患者來自河南省食管癌高發區，經過確診并行手術治療的人群，確診時間為2019年11月至2020年1月，其中男132例(66.33%)，女67例(33.67%)。

1.1.1 樣本采集收集199位食管癌患者的癌組織和癌旁組織。均為新鮮的組織樣本，在進行手術切除后30 min內進行宏觀解剖，保存在-80 ℃下。在樣本采集前病人未接受放化療等其他治療，以半定量的方式對腫瘤細胞進行視覺評分，僅選擇惡性細胞>70%的腫瘤組織進行全基因組外顯子測序。癌旁正常組織為距腫瘤邊緣至少2 cm遠的鄰近的上皮正常組織(生殖系對照)。本研究所有患者均簽署了獨立的知情同意書，均已獲得相關機構的審查和批準。

1.1.2 隨訪本研究通過打電話、家訪或聯系村醫等方法與患者或患者家屬直接聯系，或者通過新合作醫療數據庫、醫療保障局數據庫和公民死亡信息登記管理等系統查詢聯系方式進行隨訪，每半年進行一次隨訪，記錄死亡時間和主要死因等。本研究隨訪時間從手術結束開始，截止時間為全因死亡時間，為期2 a，即從隨訪成功199例開始，全部死亡結束。

1.1.3 樣本制備將199例食管癌患者的癌組織和癌旁組織進行配對，分裝到準備好的已經標記的凍存管內，樣本編號為001～199號。在樣本類型中，食管癌組織用字母T標記(tumor)，癌旁正常組織用字母N標記(normal)。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時保證每份樣品有足夠的DNA可供提取。

1.2 WES測序分析

1.2.1 DNA樣品檢測利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA樣本是否有蛋白，RNA污染及其降解程度，并用Qubit 3.0測出DNA樣品濃度，選擇0.6 μg以上的樣品進行后續建庫。

1.2.2 建庫捕獲及上機測序用Agilent液相芯片捕獲系統對人全外顯子區的DNA進行富集，Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進行建庫及捕獲，后在Illumina平臺上進行高通量測序。

1.2.3 數據質量控制高通量測序獲得的原始圖像數據，經過轉化后形成原始Raw Data測序序列。將原始Raw Data數據進行過濾，并且控制平均堿基位置測序錯誤率低于0.1%，樣本的測序reads達到95%以上的比對率，且堿基覆蓋深度達到10×以上時該點檢測的SNP(single nucleotide polymorphisms)比較可信。

1.2.4 SNP檢測和功能注釋對部分家系成員DNA進行WES測序(由諾禾致源測序公司進行) ，基于WES數據中所檢測到的SNP位點，將正常與癌組織中都有的SNP進行比對，使用bcftools軟件識別SNP，并利用ANNOVAR軟件對多態性位點進行功能注釋。

1.3 蛋白質組學分析與鑒定

采用液相色譜—質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術對199例食管癌的癌組織和癌旁組織樣本進行分析。

1.4 SNP與蛋白質組作用關系分析

采用WES測序，將基因中的突變位點和突變位點對應靶點引起的蛋白表達量之間聯系起來，進行一定的探討。

2 結果

2.1 患者rs2070426位點的SNP型

基因分析結果顯示，199例食管癌患者中，rs2070426 GG型51例(25.63%)；GC型64例(32.16%)；CC型84例(42.21%)。

2.2 SNP型與生存和蛋白表達的關系

2.2.1 不同突變位點生存結果收集199例患者的標本，并行WES測序探討PCNT基因SNP位點rs2070426多態性的3種不同基因型(GG、GC、CC)與生存的關系。在研究中發現是第21號染色體上的一個位點發生了突變，即由原來基因位點上的G變為C，因此可以得出若為CC型則為純合突變、GC型為雜合突變、而若為GG型則為野生型。通過采用SPSS軟件中的Kaplan-Meier分析畫圖比較，得出在2 a的生存隨訪中，相同的時間點3種(GG、GC、CC)基因型生存率不同，見表1。發生純合基因突變的食管癌病人的生存人數最好，雜合突變次之，野生型最差(P=0.033)。但到隨訪的最終都死亡，均為致癌基因，但發生了純合突變的人群存活率在相同的時間段內生存率相對較多。由于PCNT的改變與其它疾病或癌的發生之間有一定的關系[11-15]，是一個敏感點。但其它文中無對SNP位點rs2070426多態性與食管癌之間的關系進行探討，因此在本文中對PCNT基因SNP位點rs2070426多態性與癌癥之間關系也變得比較有價值。見圖1。

圖1 不同突變食管癌患者的生存圖

表1 PCNT種基因型與生存率的比較 199 例(%)

2.2.2 不同基因型蛋白表達量的對比SNP位點rs2070426多態性與腫瘤的發生密切相關。由于SNP位點 rs2070426不同基因型的改變，導致了對應的基因型的蛋白表達量也不相同(beta=0.267)。完全突變型CC的蛋白表達平均水平最高，GC型的蛋白表達平均水平次之，而GG型的蛋白表達平均水平最低(P<0.001)。見圖2。

圖2 rs2070426位點3種基因型食管癌患者的MACO1蛋白表達

3 討論

食管癌是常見的一種消化道惡性腫瘤。因其發生率高存活率低，目前提高病人的存活率非常重要，但這一問題至今沒有精準的解決方法。

已有研究發現，食管癌的預后生存率，除了與飲食有關系以外，還與內部的基因的改變存在著非常大的關系。因此作者對內部基因方面進行了一定的探討。本文采用同一批手術相同的時間段內的食管癌患者的SNP位點rs2070426的不同突變基因型存活率多少進行研究。采用WES技術能直接對蛋白編碼序列進行測序，找出影響蛋白結構的變異。為下一步的研究提供了幫助。在基因突變探討的過程中，發現PCNT基因SNP rs2070426位點發生了改變。通過圖1探討中了解到食管癌患者2 a生存率CC型高于GC型與GG型患者，突變等位基因越多，2 a時間段的分析中存活率反而越高。從圖2中了解到純合突變型CC的蛋白表達平均水平最高，GC型的蛋白表達平均水平次之，而GG基因型的蛋白表達平均水平最低(P<0.001)。從兩個圖中了解到PCNT基因位點的突變是一個好的突變，但其他文章中并未對PCNT SNP rs2070426位點與食管癌生存之間關系進行研究，只探討了PCNT與其它病的關系[16]，是一個敏感點。

因此本文這一研究是非常有意義的。這一基因位點突變引起的蛋白表達改變進而影響生存是通過影響對應的MACO1靶點引起的，雖然其他文章也研究了MACO1與腫瘤的發生有關[17]。本研究對闡明PCNT基因SNP位點rs2070426多態性對應靶點MACO1與蛋白表達量的關系非常有意義。本文針對SNP位點rs2070426，探討基因位點的改變與食管癌預后生存差異的關系，進而了解其可能治療靶點，對以后食管癌的研究具有一定意義。是否可以通過此基因的改變延長病人的生命，還需要進一步的研究跟進。

綜上所述，食管癌預后的存活率與位點突變數有關。PCNT基因突變的3種位點與蛋白表達量呈現正相關性。從本文中可知這是一個正向突變生存位點。作者將在下一步的研究中深入了解PCNT基因SNP位點rs2070426多態性與食管癌預后的存活關系，為以后的個體化治療提供一個新的線索，進而開啟食管癌研究的新途徑，延長食管癌患者的生存時間，這將是一個有價值的研究思路。