CNTNAP3B基因單核苷酸多態性與199例食管鱗癌患者生存關聯分析

陳亞杰，趙學科，徐瑞華，宋 昕，魏夢霞，李 貝，范宗民，胡景峰，王 苒，孫 琳，謝葉真，馬琳琳，喬佳欣，王立東

食管鱗癌是全球最常見的六大惡性腫瘤之一(發病率和死亡率均居第六位)，中國是食管鱗癌發病率和死亡率最高的地區(發病率居第六位，死亡率居第四位)[1]。研究顯示遺傳多態性是影響食管癌易感性的重要因素。近年來分子流行病學資料表明漢族人群食管癌遺傳易感基因主要包括抑癌基因、癌基因、代謝酶相關基因、DNA 切除修復相關基因和細胞因子基因等，深入了解易感基因的表達變化，有助于明確食管癌的發病機制[2-3]。目前已發現一些單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點，如rs671對食管鱗癌的早期篩查具有一定的臨床意義[4]。SNP與多種惡性腫瘤的遺傳易感性已被相關研究證實[5-7]。因此，本研究探討人類CNTNAP3B基因rs3739620位點SNP不同基因型與食管鱗癌患者的相關性，為食管鱗癌患者的預后生存提供新思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

1.1.1 研究對象的采集共收集來自高發地區醫院199位食管鱗癌患者的癌組織。所用樣品均為新鮮組織樣本,在手術切除后30 min內進行取樣，并保存在-80 ℃下。樣本采集前未接受放化療等其他治療。以半定量的方式對腫瘤細胞進行病理學評分，僅選擇惡性細胞>70%的腫瘤樣品進行全基因組外顯子測序(WES)。所有患者都簽署了獨立的知情同意書，用于取樣和測序分析。本研究已獲得了相關機構的審查和批準。

1.1.2 研究對象的隨訪本研究主要通過電話、家訪和村醫與患者或患者家屬直接聯系，或通過新合作醫療數據庫、醫療保障局數據庫和公民死亡信息登記管理等系統查詢方式進行隨訪，每半年進行一次隨訪，記錄去世時間和主要死因等。本研究隨訪截止到2021年12月1日，隨訪成功199例。

1.1.3 組織樣本的制備將199例食管鱗癌患者的癌組織分裝到準備好的已經標記的凍存管內，樣本編號為001～199號。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時保證每份樣品有足夠的DNA可供提取。

1.2 WES測序SNP分析

1.2.1 DNA樣品檢測利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA樣本是否有蛋白、RNA污染及其降解程度。并用Qubit3.0測出DNA樣品濃度，選擇0.6 μg以上的樣品進行后續建庫。

1.2.2 建庫捕獲及上機測序采用Agilent液相芯片捕獲系統對人全外顯子區的DNA進行富集，Agilent SureSelectHumanAllExonV6試劑盒進行建庫及捕獲，后在Illumina平臺上進行高通量測序。

1.2.3 數據質量控制高通量測序獲得的原始圖像數據經過轉化后形成原始Raw Data測序序列。將原始Raw Data數據進行過濾，并且控制平均堿基位置測序錯誤率低于0.1%，樣本的測序reads達到95%以上的比對率，且堿基覆蓋深度達到10×以上時該點檢測的SNP比較可信。

1.2.4 SNP檢測和功能注釋使用bcftools軟件識別SNP，并利用ANNOVAR軟件對多態性位點用進行功能注釋。注釋包括dbSNP數據庫、千人基因組計劃，包含變異的位置、類型，保守性及有害性預測等。

1.3 蛋白質組學分析與鑒定

采用液相色譜—質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術對199例食管癌的癌組織樣本進行分析。

1.4 eQTL分析整合eQTL分析所獲得的SNP位點，用HaploView 軟件排除冗余，采用Sequenom MassARRAY中通量基因分型平臺，對來自高發地區醫院的199位食管鱗癌患者進行基因分型檢測并且建立線性模型推測CNTNAP3B基因對MRPL18蛋白表達的影響。

1.5 統計學分析

統計學處理采用SPSS 21.0進行分析。高發區食管鱗癌組織的SNP影響蛋白的表達從而導致腫瘤的發生采用雙重線性回歸檢驗，采用Kaplan Meier方法進行2 a生存分期。檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1 CNTNAP3B基因rs3739620位點不同基因型對食管鱗癌生存期的影響

統計學分析顯示SNP不同基因型食管鱗癌患者的生存之間有顯著差異(P<0.02)。在單個SNP 位點分析時，發現C/T基因型比C/C基因型生存率高，T/T基因型比C/T基因型生存率高，說明rs3739620位點T/T基因型是患者的保護因素。此外rs3739620位點T/T、C/T、和C/C基因型頻率分別為4.0%、56.2%和39.6%，見圖1。

圖1 CNTNAP3B基因生存分期

2.2 CNTNAP3B基因rs3739620位點不同基因型對MRPL18蛋白表達水平的影響

為了探討rs3739620位點不同基因型影響食管鱗癌患者生存的可能機制，本研究對該位點3種不同基因型患者的蛋白質組學數據進行了比較分析，結果顯示：3組不同基因型患者間的MRPL18蛋白表達水平存在顯著差異(P<0.001)，其中C/C基因型組的MRPL18蛋白表達水平最高，C/T 基因型組次之，T/T基因型組最低，見圖2。

圖2 rs3739620位點不同基因型患者MRPL18蛋白的表達情況

為了矯正其他混雜因素的影響，作者應用表達數量性狀位點(expression quantitative trait locus,eQTL)算法進一步分析了rs3739620位點不同基因型與MRPL18蛋白表達水平的關系，結果顯示：C/C基因型組、C/T 基因型組、T/T基因型組食管鱗癌患者MRPL18蛋白的表達水平呈線性下降趨勢(P<0.001)，其在擬合方程中對應的系數(β)為-0.32，即當某患者rs3739620位點上攜帶的突變基因(T)數量較其他患者每多出1個時，其MRPL18蛋白的表達水平約降低0.32個單位。

3 討論

食管癌具有明顯的地域分布差異，但是在相同環境因素下的人群只有少數罹患食管癌，可見個體基因型在食管癌的發生發展中起重要的作用[8-9]。從基因水平判斷患者的病變發展情況以及預后的評估正逐漸成為研究的熱點[10]。單核苷酸多態性主要是指DNA序列上變異頻率大于>1%的單個核苷酸變異[11]，可以認為這些SNP是人群間異質性的來源之一，而且SNP在DNA序列上分布廣泛，有研究認為每100～300個堿基就能發現一個SNP[12]。在NCBI網站中查詢發現，CNTNAP3B基因即接觸相關蛋白家族成員3B(contactin associated protein family member 3B)，位于人類第9號染色體，突變點是rs3739620。該基因8號外顯子1 316位堿基C突變成了T，439位氨基酸由脯氨酸變成了亮氨酸。

本研究探討CNTNAP3B基因rs3739620位點SNP不同基因型與食管鱗癌患者生存期之間的相關性。在單個基因位點分析rs3739620位點SNP不同基因型與食管鱗癌患者的生存有顯著的差異，有統計學意義。在不同基因分型中，發現T/T基因型的生存率最高，推測rs3739620位點突變對食管鱗癌患者預后生存具有保護作用。提示CNTNAP3B基因單核苷酸多態性與食管鱗癌患者生存有關，可能作為預測食管鱗癌術后患者生存的潛在預后標志物。

CNTNAP3B基因rs3739620位點突變導致MRPL18蛋白表達下調，尤其是T/T基因型蛋白表達量最低。研究發現MRPL18蛋白在腫瘤中高表達[13]，推測這個靶蛋白可能是腫瘤中潛在的靶基因，再次說明rs3739620突變可能是影響食管鱗癌患者生存的機制。SNP造成靶蛋白表達量的改變，本研究目前僅闡述了二者之間的相關性，可能是一種潛在的Trans eQTL調控作用，需要后期進一步研究證明。

綜上所述，CNTNAP3B基因rs3739620位點T/T基因型生存期最好，并且CNTNAP3B基因影響MRPL18蛋白表達，對食管鱗癌患者預后生存具有一定的臨床指導意義。