SEZ6L2基因單核苷酸多態性與199例食管癌患者術后生存期關聯分析

馬琳琳，趙學科，宋 昕，徐瑞華，魏夢霞，李留玉,，尤 朵,3，王 苒，韓雪娜，孫 琳,，陳亞杰,，喬佳欣，謝葉真，白合林，王立東

食管癌是全球最常見的六大惡性腫瘤之一，有極高的發病率和死亡率[1-2]。每年全球新發食管癌患者約50萬例，其中發生在中國的占2/3[3-4]。中國食管癌突出的流行病學特點是顯著的地域性分布和明顯的家族聚集性，從而形成明顯的食管癌高低發區[5]。河南、山西和河北交界的太行山地區，是中國，也是全球食管癌發病率和死亡率最高的地區，特別是河南林州[6-8]。中國97%以上的食管癌為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[9]，食管癌的發生、發展是遺傳和環境因素交互作用的結果[10]。以往絕大多數報道關于食管癌的發生是由各種外在因素引起的，而內在因素，比如基因突變在腫瘤發展的過程中同樣起到非常重要的作用。此外，從遺傳流行病學得出，涉及癌變過程中不同的基因多態性也可能會使個體對食管癌的易感性發生改變，這種多態性也對癌癥的預防和治療起到了非常關鍵的作用[11]。

β-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase，GAL)是一種溶酶體外糖苷酶，通過釋放β連接的末端半乳糖殘基參與糖共軛物的分解代謝。當酒精和尼古丁依賴性與結腸癌重合，高活性的β-半乳糖苷酶可能加速了癌癥的生長、侵襲、轉移和成熟[12]。β-半乳糖苷酶在GH分泌和NFPA中有明顯的高表達，在癌組織中也有顯著的高表達。作者推測，這可能是腫瘤惡性進展罕見的原因[13]。同時也有大量研究表明β-半乳糖苷酶1(GLB1)參與腫瘤的發生發展和細胞衰老[14]。因此，本課題研究SEZ6L2 rs7533174單核苷酸多態性和GLB1之間的關聯，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象的采集

納入的199例患者均來自于鄭州大學第一附屬醫院省部共建食管癌防治國家重點實驗室中的50萬例食管癌患者臨床信息數據庫[15-16]。患者均來自于河南省食管癌高發區的某市級醫院，經醫院確診并進行手術治療，確診時間為2019年11月至2020年1月。其中男132例(66.33%)，女67例(33.67%)，每位患者均簽了知情同意書，并經鄭州大學倫理委員會批準。收集199例ESCC患者的癌組織和癌旁組織，均為手術切除后30 min內的新鮮組織樣本，并進行宏觀解剖，然后保存在-80 ℃冰箱。樣本采集前沒有接受放化療等抗肺瘤治療，然后以半定量的方式對腫瘤細胞進行視覺評分，僅選擇其中惡性細胞>70%的腫瘤細胞進行全基因組外顯子測序。癌旁正常組織是從距腫瘤邊緣至少2 cm遠的鄰近上皮正常組織(對照)，用于取樣和分子分析。

本研究主要通過電話、到家隨訪、鄉村醫生與患者或患者家屬直接聯系，以及新合作醫療數據庫、醫療保障局數據庫和公民死亡信息登記管理等系統查詢方式進行隨訪，每半年進行一次隨訪，記錄健在或去世以及去世時間和主要死因等。

1.2 組織樣本的制備

將199例ESCC患者的癌組織和癌旁組織配對，分裝到提前準備好的已經標記的凍存管內，樣本編號為001～199號，ESCC組織用字母T標記(Tumor)，癌旁正常組織用字母N標記(Normal)。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時要保證每份樣品有足夠的DNA可供提取，然后用CTAB法提取DNA。

1.3 多組學SNP位點捕獲、檢測與篩選

1.3.1 DNA樣品檢測利用瓊脂糖凝膠電泳來分析DNA樣本是否含有蛋白、RNA污染及其降解程度。如果DNA出現降解，對應的條帶就會變暗或者消失。并用Qubit 3.0測出DNA樣本濃度，選擇0.6 μg以上的樣品進行后續建庫。

1.3.2 建庫捕獲及上機測序采用Agilent液相芯片捕獲系統對人全外顯子區的DNA進行富集，Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進行建庫及捕獲，后在Illumina平臺上進行高通量測序。

1.3.3 數據質量控制高通量測序獲得的原始圖像數據經過轉化后形成原始Raw Data測序序列。將原始Raw Data數據進行過濾，并且控制平均堿基位置測序錯誤率低于0.1%，樣本的測序reads達到95%以上的對比率，且堿基覆蓋深度達到10×以上時，該點檢測的SNP相對比較可信。

1.3.4 多組學SNP位點篩選實驗方法為全基因組外顯子測序WES(whole exome sequencing)(WES測序由諾禾致源測序公司進行)，基于WES數據中所檢測到的SNP位點，經過將正常與癌組織中都有的SNP進行比對，共有62萬個SNP；其中以編碼區非同義突變、P<0.2為條件篩選出的SNP位點有3 897個；在GT和Mutation表中都存在且生存曲線有差異的有797個位點。rs75331747 SNP在患者的癌組織和癌旁組織中是一致的。

1.4 蛋白表達的測定

采用液相色譜—質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術對199例ESCC患者的癌組織和癌旁組織樣本進行分析。

2 結果

2.1 SEZ6L2基因SNP rs75331747與ESCC生存與預后的關聯性分析

199例ESCC患者中，有136例G/G基因型個體，51例G/T基因型個體，12例T/T基因型個體；T/T基因型個體的生存率顯著高于G/G基因型個體，T/T基因型個體的生存率高于G/T基因型個體，G/T基因型個體的生存率高于G/G基因型個體(P<0.001)。見圖1。

圖1 3種基因型術后生存分析比較

2.2 SEZ6L2 rs75331747基因型與GLB1蛋白表達之間的關系

eQTL分析發現，eQTL距離調控基因非常遠，大于20 Mb以上，可能通過調控SEZ6L2基因產生的轉錄調控蛋白來介導靶基因的表達。作者做了rs75331747與GLB1蛋白表達量關系的研究。相對于rs75331747的參考型GG，突變型TT型蛋白表達量最少，rs75331747突變后，通過調控SEZ6L2基因產生的轉錄子，顯著降低GLB1的表達。見圖2。

圖2 rs75331747的3種基因型GLB1蛋白表達

3 討論

研究發現，食管癌的發生和發展是基因—遺傳—環境交互作用共同導致的結果[10]。本研究探討SEZ6L2基因rs75331747(G>T)多態性與ESCC患者生存之間的關系。在單個核苷酸位點分析時，SEZ6L2基因rs75331747 SNP位點與ESCC患者生存有統計學意義上的關聯。提示SEZ6L2基因SNP與ESCC患者生存結局有關系，可能成為預測ESCC患者生存的潛在預后標志物。

通過檢查rs75331747遺傳變異對GLB1表達的潛在調節作用，發現rs75331747 G等位基因是風險等位基因。在199例人食管組織標本的基因型—蛋白相關分析中，rs75331747 G/T或G/G與GLB1蛋白表達顯著增加相關(P<0.001)。本研究數據表明，SEZ6L2 rs75331747 SNP與ESCC的易感性相關，GLB1可能參與ESCC發生。

SEZ6L1基因SNP rs75331747影響GLB1蛋白的表達，GLB1蛋白的表達與ESCC患者的生存預后相關。正常人SEZ6L1基因rs75331747的第713位堿基是G，當G基因突變后，GLB1蛋白的表達量減少，但預后變好。由此可見，SEZ6L2基因SNP rs75331747可能是致病SNP。

衰老是一種穩定的生長停滯，損害了受損、陳舊或癌前細胞的復制，因此有助于組織的穩態。衰老細胞在衰老過程中積累，與癌癥、纖維化和許多與年齡相關的疾病有關。衰老細胞的一個普遍特征是溶酶體β-半乳糖苷酶的活性升高，這已被用作衰老的標志(衰老相關的β-氨基半乳糖苷酶活性)。GLB1增加與細胞不可逆生長停滯和衰老相關[17]。rs75331747通過影響β-半乳糖苷酶從而改變患者的生存期。

本研究樣本量較少，在一定程度上影響了檢驗效能。因此，本研究結果需要更大樣本量的研究來進一步驗證。本研究發現攜帶rs75331747 T基因型的ESCC患者，其生存結局更好，而關于其影響機制，目前尚未完全闡明，需要進一步深入開展SNP功能學研究來解析其影響ESCC預后的分子機制[11]。

綜上所述，SEZ6L2基因SNP rs75331747可能影響ESCC患者的生存結局，可以作為今后ESCC患者生存結局的潛在預后標志物。