響應面法優化石花菜酸奶發酵工藝研究

朱豐，劉施琳，李天驕，林圣楠，黃金城，王紅麗，趙藝凡，林向陽*

（福州大學生物科學與工程學院，福建福州350108）

響應面法優化石花菜酸奶發酵工藝研究

朱豐，劉施琳，李天驕，林圣楠，黃金城，王紅麗，趙藝凡，林向陽*

（福州大學生物科學與工程學院，福建福州350108）

采用響應面法優化石花菜酸奶發酵工藝。采用中心組合試驗設計，考察不同雙歧桿菌接種量、石花菜添加量、蔗糖添加量、發酵時間對感官評價（R1）、活菌數（R2）兩個指標的影響。結果表明，石花菜瓊膠寡糖能增加酸奶的持水力，改變酸奶的組織狀態。石花菜酸奶發酵的最佳工藝條件為蔗糖添加量11%、石花菜添加量20%，雙歧桿菌接種量1.5%，發酵時間為6 h，感官評分為80分，活菌數為2.65×109CFU/mL。

石花菜（Gelidium amansii）又名洋菜、燕菜精、石生花，是一種重要的海產經濟紅藻[1]，是具有很高食療和經濟價值的植物膠。在我國黃海、渤海、東海等海域以及朝鮮、日本等地均有分布。石花菜富含褐藻酸鹽類物質、淀粉類硫酸酯、礦物質和多種維生素等營養物質，具有降壓、降血脂、清肺化痰、滋陰降火、清熱燥濕和解暑功效。其營養均衡，含有豐富的膳食纖維，熱量低[2]，是一種備受歡迎的減肥保健食品。石花菜瓊膠寡糖是一種新型的益生元[3]，能刺激雙歧桿菌與乳酸桿菌在腸道中的生長，改善腸道菌群結構[4-5]。目前，我國對石花菜產品的開發利用尚不充分，主要加工成果凍，造成較大資源浪費。酸奶中含有大量活性益生菌，其營養豐富，具有獨特風味。將石花菜瓊膠和寡糖添加到酸奶中，不僅可以發揮石花菜生理功能，改善酸奶質構，還可以促進益生菌生長[6-7]。本試驗將石花菜與全脂奶粉混合發酵，制成集海藻營養與動物營養于一體的保健型酸奶，以活菌數、感官評價為考察指標，對蔗糖添加量、石花菜添加量、雙歧桿菌接種量、發酵時間進行優化，為石花菜應用提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石花菜：青島海悠悠商貿有限公司；高蛋白脫脂高鈣奶粉：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；白砂糖（食品級）：廈門古龍食品有限公司；雙歧桿菌：杜邦丹尼斯克公司；石花菜瓊膠寡糖：實驗室前期制備；厭氧產氣袋、圓底立式培養袋、氧氣指示劑：青島雅各化學試劑銷售有限公司；MRS瓊脂培養基：杭州百思生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

CJM-SC-A型高能納米沖擊磨：秦皇島太極環納米制品有限公司；MINI MR核磁共振分析儀：上海紐邁電子科技有限公司；FM200實驗室高剪切分散乳化機：上海弗魯克流體機械制造有限公司；KQ-300VDE型三頻數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；BC/BD-217CH冷柜：河南新飛電器有限公司；BS110S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HZP-150型全溫振蕩培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；雙人超凈工作臺：東莞市百福盛凈化設備科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

石花菜的前處理：將干凈的石花菜經高能納米沖擊磨粉碎得到石花菜粉末，然后在石花菜粉中加入蒸餾水，在90℃、80 kHz條件下超聲120 min，充分提取石花菜中的營養成分，并趁熱抽濾得石花菜提取液。

復原乳制備：脫脂奶粉與水配制成12.5%的復原乳。

石花菜瓊膠寡糖前期制備：稱取適量石花菜粉末備用，加入一定體積的2%（V/V）食品級磷酸溶液，置于高溫滅菌鍋中高溫高壓一段時間，使石花菜瓊膠充分降解。取出后過濾，濾液用食品級氫氧化鈉調pH值至7，加入3倍體積乙醇溶液4℃下靜置過夜。離心（7 000 r/min，20 min）去除沉淀，經減壓濃縮得到瓊膠降解產物。

混合均質：將復原乳和白砂糖按一定比例加入熱的石花菜提取液中，并加入10 g/L石花菜瓊膠寡糖，用高剪切分散乳化機13 000 r/min均質2 min。

滅菌冷卻：將混合液巴氏滅菌30 min后備用。

接種發酵：將酸奶發酵劑接種于冷卻后的混合液中，置于43℃恒溫培養箱內發酵4～6h至凝乳，酸度達70～80°T即可停止發酵。

冷藏后熟：將已經凝固的酸奶置于4℃冰箱中冷藏24h，以降低益生菌活力和產酸速度，產生良好的風味[8-11]。

1.3.2 單因素試驗設計

（1）蔗糖添加量：石花菜添加量25%，雙歧桿菌接種量1.5%，發酵時間5.5 h時，考察蔗糖添加量（7%、9%、11%、13%、15%）對酸奶活菌數及感官評價的影響。

（2）石花菜添加量：蔗糖添加量11%，雙歧桿菌接種量1.5%，發酵時間5.5 h時，考察石花菜添加量（10%、15%、20%、25%、30%）對酸奶活菌數及感官評價的影響。

（3）雙歧桿菌接種量：蔗糖添加量11%，石花菜添加量25%，發酵時間5.5h，考察雙歧桿菌接種量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）對酸奶活菌數及感官評價的影響。

（4）發酵時間：蔗糖添加量11%，石花菜添加量25%，雙歧桿菌接種量1.5%，考察發酵時間（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）對酸奶活菌數及感官評價的影響。

1.3.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果，選擇雙歧桿菌接種量（A）、石花菜添加量（B）、蔗糖添加量（C）、發酵時間（D）作自變量，以活菌數（R1）、感官評分（R2）為響應值，進行響應面優化試驗。3次平行試驗，取平均值。響應面試驗設計因素與水平見表1[12]。

表1 酸奶發酵條件優化響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for yogurt fermentation conditions optimization

1.3.4 指標測定

活菌數測定：依照GB 19302—2010《發酵乳》對活菌數進行測定，3次平行試驗，取平均值[13]。

感官評定：參照GB 19302—2010《發酵乳》中所列的檢驗項目，本研究采用雙盲法邀請15個經過專業感官訓練的研究生對石花菜酸奶的色澤、氣味、凝乳狀態、口感等感官指標進行評定。3次平行試驗，取其平均值作為最終評價結果，滿分100分，感官評分標準見表2[14]。

表2 石花菜酸奶感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standard forGelidium amansiiyogurt

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 蔗糖添加量對活菌數及感官評價的影響

由圖1可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官評分先增加后減小，當添加量為11%時感官評分最高。這是因為蔗糖能促進雙歧桿菌的生長，產生的風味物質掩蓋石花菜的海藻腥味，當蔗糖添加量過多時會造成甜度過高，且發酵過度產酸量增大，導致感官評分下降。隨著蔗糖添加量的增加，活菌數也呈先增加后減少趨勢，當添加量為11%時活菌數最高。可能是因為蔗糖添加量增加，菌生長可利用的碳源增多，活菌數隨之增加。當蔗糖添加量過多時，高滲透壓影響了菌的生長，造成菌脫水死亡，活菌數隨之減少。因此，蔗糖最適添加量為11%。

圖1 蔗糖添加量對石花菜酸奶感官評分及活菌數的影響Fig.1 Effect of sucrose addition on sensory score and viable count ofG.amansiiyogurt

2.1.2 石花菜添加量對活菌數及感官評價的影響

圖2 石花菜添加量對石花菜酸奶感官評分及活菌數的影響Fig.2 Effect ofG.amansiiaddition on sensory score and viable count ofG.amansiiyogurt

由圖2可知，隨著石花菜添加量的增加，感官評分也先增加后減小，當添加量達20%時，感官評分最高。這是因為石花菜的添加量使得酸奶口感變得細膩潤滑，當石花菜添加量過多，海藻風味過重，影響感官。隨著石花菜添加量的增加，活菌數也先增加后減小，當添加量達20%時，活菌數最多。這是因為隨著石花菜添加量的增大，菌所能利用的能量充足，使得發酵充分，當石花菜添加量過大時，形成高滲透壓，不利于雙歧桿菌生長，活菌數減少[15-16]。因此，石花菜最適添加量為20%。

2.1.3 雙歧桿菌接種量對活菌數及感官評價的影響

由圖3可知，隨著雙歧桿菌接種量的增加，感官評分先增加后減小，當添加量為1.5%時，感官評分最高。這是因為益生菌使乳糖轉化成乳酸，乙醛的產量與酸度有關，接種量較少的時候，發酵不完全造成口感酸度不夠，接種量過多的時候會造成凝乳中蛋白質脫水，使乳清析出較多，影響感官。活菌數也隨雙歧桿菌接種量增加先增加后減小，這主要是因為接菌量越多，菌繁殖越快。當接菌量過多時，酸對菌有抑制作用，使活菌數減少。因此，最佳接種量為1.5%。

圖3 雙歧桿菌接種量對石花菜酸奶感官評分及活菌數的影響Fig.3 Effects ofBifidobacteriuminoculum on sensory score and viable count ofG.amansiiyogurt

2.1.4 發酵時間對活菌數及感官評價的影響

圖4 發酵時間對石花菜酸奶感官評分及活菌數的影響Fig.4 Effects of fermentation time on sensory score and viable count ofG.amansiiyogurt

由圖4可知，隨著發酵時間的增加，感官評分先增加后減小，當發酵時間為5 h時，感官評分最高。這是因為液態奶不斷發酵，凝乳形成，產生風味物質，當發酵時間過長，產酸增加，酸會破壞原來已形成的膠體結構，使水分游離出來，造成乳清析出，所形成的酸奶質地松散、口感酸澀。活菌數先增加，后趨于平穩略降低，這是因為隨著發酵時間延長，雙歧桿菌增長時間增加，活菌數增多。當發酵時間過長，代謝產物累積影響菌生長，活菌數減少[17-19]。因此，最佳發酵時間為5 h。

2.2 模型的建立及參數分析結果

石花菜酸奶發酵中心組合試驗設計矩陣及試驗結果見表3。蔗糖添加量、石花菜添加量、雙歧桿菌接種量、發酵時間對感官評價（R1）、活菌數（R2）的二次多元多項回歸式模型：

對于上述各回歸模型進行方差分析，并對模型系數進行顯著性檢驗（表4）。各模型方差分析結果顯示，活菌數、感官評價2個模型P值均＜0.01，因此感官評價和活菌數的模型極顯著；各模型失擬項P值分別為0.071 0和0.401 0，均不顯著（P＞0.05）；同時各模型的R2均接近1，表明試驗數據與回歸數學模型擬合性良好，能夠用上述模型較好地預測各指標的實際值。

表3 酸奶發酵條件優化響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface methodology for yogurt fermentation conditions optimization

表4 響應面試驗結果及方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology results

各模型回歸系數顯著性檢驗結果見表4。由表4可知，各試驗因素對感官評價和活菌數2個指標的影響為線性關系且極顯著（P＜0.01）；石花菜添加量和雙歧桿菌接種量的交互作用、蔗糖添加量的二次項、石花菜添加量的二次項、雙歧桿菌接種量的二次項對感官評價和活菌數線性效應極顯著（P＜0.01）；蔗糖添加量和石花菜添加量、蔗糖添加量和雙歧桿菌接種量、發酵時間的二次項的交互作用對活菌數影響均極顯著（P＜0.01），對感官評價影響不顯著（P＞0.05）；蔗糖添加量和發酵時間的交互作用對感官評價和活菌數影響均不顯著（P＞0.05）。

表5 不同試驗因素回歸系數的檢驗Table 5 Testing of regression coefficients of different experimental factors

2.3 響應曲面分析與優化

利用Design-Expert 8.0.6軟件中的等高線圖和響應曲面圖對4因素間的交互作用進行分析。

由圖5可知，在雙歧桿菌接種量、石花菜添加量和發酵時間不變的情況下，隨著蔗糖添加量的增加，感官評分先增加后減小。這主要是一定量的蔗糖促進了細菌的生長，使發酵及代謝加快，產生風味物質掩蓋石花菜海藻腥味，但蔗糖添加過多會造成過甜，發酵過度產酸，影響感官。在蔗糖添加量、雙歧桿菌接種量和發酵溫度不變的情況下，隨著石花菜添加量的增加，感官評分也先增加后減小，這是因為隨著石花菜添加量，酸奶口感變得細膩潤滑，當石花菜添加量過多，海藻風味過重，影響感官。在蔗糖添加量、石花菜添加量、發酵時間不變的條件下，感官評分隨雙歧桿菌接種量增加先增加后減小，益生菌使乳糖轉化成乳酸，乙醛的產量與酸度有關，接種量較少的時候，發酵不完全造成口感酸度不夠，接種量過多的時候會造成凝乳中蛋白質脫水，使乳清析出較多，同時也會增加生產成本[20-21]。

圖5 蔗糖添加量、石花菜添加量、雙歧桿菌接種量交互作用對感官評價影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose addition,G.amansiiaddition and Bifidobacteriuminoculum on sensory evaluation

圖6 蔗糖添加量、石花菜添加量、雙歧桿菌接種量、發酵時間交互作用對活菌數影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose addition,G.amansiiaddition and Bifidobacteriuminoculum on viable count

由圖6可知，在雙歧桿菌接種量、石花菜添加量和發酵時間不變的情況下，隨著蔗糖添加量增加，活菌數增加，蔗糖添加量過多時，高滲透壓影響了乳酸菌的生長，造成乳酸菌脫水死亡，活菌數減少[14-15]。在蔗糖添加量、雙歧桿菌接種量和發酵溫度不變的情況下，隨著石花菜添加量的增加，活菌數也先增加后減小，這是因為隨著石花菜添加量的增加，菌所能利用的能量充足，使得發酵充分，當石花菜添加量達25%后，形成高滲透壓，不利于菌生長，活菌數減少[16]。在蔗糖添加量、石花菜添加量、發酵時間不變的情況下，活菌數隨雙歧桿菌接種量增加先增加后減少，這主要是因為雙歧桿菌接種量增多，菌繁殖加快。當雙歧桿菌接種量過多時，酸對菌有抑制作用，活菌數減少。在蔗糖添加量、雙歧桿菌接種量和石花菜添加量不變的情況下，隨著發酵時間的增加，活菌數先增加后減小。這是因為隨著發酵時間延長，雙歧桿菌增長時間增加，活菌數增多。當發酵時間過長，代謝產物累積影響菌生長，活菌數減少[22-23]。

2.4 工藝優化參數結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對數據進行分析，以感官評價最高，活菌數最高為優化指標，得到石花菜酸奶發酵工藝為蔗糖添加量11.34%，石花菜添加量20%，雙歧桿菌接種量1.5%，發酵時間5.93 h，在此條件下模擬預測感官評價為80.58分，活菌數2.83×109CFU/mL。根據實際情況進行修正：蔗糖添加量11%，石花菜添加量為20%，雙歧桿菌接種量1.5%，發酵時間為6 h。

2.5 驗證結果

采用上述最佳工藝進行驗證試驗，3次平行試驗，測定其感官評價及活菌數，得到的平均值分別為80分和2.65×109CFU/mL，與預測值感官評分80.58分和活菌數2.83×109CFU/mL基本相符，表明該二次方程模型對優化石花菜酸奶發酵工藝可行。

3 結論

本研究利用前期試驗成果即石花菜瓊膠降解后的瓊膠寡糖與雙歧桿菌進行復配成益生元復合菌，添加入石花菜酸奶中進行發酵，研究蔗糖添加量、石花菜添加量、雙歧桿菌接種量和發酵時間對石花菜酸奶發酵的影響。在單因素基礎上進行響應面試驗優化其工藝條件，得出最佳發酵工藝參數為蔗糖添加量11%，石花菜添加量20%，雙歧桿菌接種量1.5%，發酵時間為6 h，經試驗得到的感官評分為80分，活菌數為2.65×109CFU/mL，與預測值基本相符。石花菜酸奶與市售酸奶相比，其感官評分較低，風味有待提高，持水性良好，總體符合市售要求。因此，石花菜酸奶的研發對野生深海海藻的利用提供理論依據和試驗基礎。

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Optimization of fermentation process ofGelidium amansiiyogurt by response surface methodology

ZHU Feng,LIU Shilin,LI Tianjiao,LIN Shengnan,HUANG Jincheng,WANG Hongli,ZHAO Yifan,LIN Xiangyang*
(College of Biological Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

The fermentation process ofGelidium amansiiyogurt was optimized by response surface methodology.The effects of differentBifidobacteriuminoculum,G.amansiiaddition,sucrose addition and fermentation time on two response variables including sensory evaluation(R1)and viable count(R2)were investigated by central composite design.The results indicated thatG.amansiiagar oligosaccharide could increase the water holding capacity ofG.amansiiyogurt,and change yogurt structure.The optimum fermentation parameters of the yogurt were as follows:sucrose 11%,G.amansii20%,Bifidobacteriuminoculum 1.5%and fermentation time 6 h.The sensory score and the viable count of the yogurt were 80 and 2.65×109CFU/ml,respectively.

Gelidium amansii;agar oligosaccharide;yogurt;response surface analysis

TS252.54

0254-5071（2017）04-0103-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.022

2017-01-22

福建省科技廳重點項目（2009N0036）

朱豐（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

*通訊作者：林向陽（1969-），男，教授，博士，研究方向為生物質資源化。

關鍵詞：石花菜；瓊膠寡糖；酸奶；響應面分析