多套儀器組成的新型冠狀病毒核酸檢測系統(tǒng)的性能驗證方案設(shè)計*

軒乾坤，溫冬華，李廣波，郭文正，楊思敏，羽曉瑜

同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院南院檢驗科，上海 200123

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)正在全世界范圍內(nèi)暴發(fā)，實驗室核酸檢測結(jié)果是COVID-19診斷的重要依據(jù)。《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第八版)》及其附件10《新冠病毒樣本采集和檢測技術(shù)指南》[1]指出：新型冠狀病毒的病原學(xué)檢查應(yīng)對其進行核酸檢測[2-7]，現(xiàn)國內(nèi)各醫(yī)學(xué)實驗室基本采用實時熒光定量PCR來進行檢測。黨中央、國務(wù)院高度非常重視新型冠狀病毒核酸檢測工作，中央應(yīng)對新型冠狀病毒感染肺炎疫情工作領(lǐng)導(dǎo)小組會議作出部署，要求著力提升新型冠狀病毒核酸檢測能力，盡力擴大檢測范圍，要求加強各地實驗室建設(shè)，使其具備開展新型冠狀病毒核酸檢測的能力[8-10]。故全國各三級醫(yī)院、傳染病專科醫(yī)院、縣(區(qū))級及以上疾控機構(gòu)、海關(guān)等實驗室均安裝了多臺核酸提取儀和多臺實時熒光定量PCR儀，可以多臺儀器同時工作以完成新冠病毒核酸檢測工作。

《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則(ISO15189:2012)》和《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第八版)》的附件10《新冠病毒樣本采集和檢測技術(shù)指南》均要求，實驗室應(yīng)對檢測系統(tǒng)(包括核酸提取試劑、核酸提取儀、核酸擴增試劑和熒光定量PCR儀)進行性能驗證，以確定檢驗程序的性能特征是否符合廠商聲明[1，11-12]。現(xiàn)通用的新型冠狀病毒核酸檢測均包括核酸提取和PCR擴增兩個過程，其核酸提取試劑和核酸擴增試劑均是固定配套使用，為單一因素，而核酸提取儀和熒光定量PCR儀均有多臺，并且存在隨機組合的工作模式。現(xiàn)有文獻報道的性能驗證方案均是針對單套檢測系統(tǒng)或不同試劑檢測性能的比較[13-18]，因而對于多套檢測系統(tǒng)進行性能驗證方案設(shè)計，選擇最好的方案，對保證檢測質(zhì)量，提高臨床工作效率，降低消耗，具有重要意義。根據(jù)中國合格評定國家認可委員會(CNAS)2019年2月15日發(fā)布并實施的《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[19]，針對臨床工作中新型冠狀病毒核酸在多臺核酸提取儀和熒光定量PCR儀上提取和檢測的情況，筆者制定出三套性能驗證方案，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

此次性能驗證方案以4臺核酸提取儀和4臺熒光定量PCR儀為例來設(shè)計，4臺核酸提取儀分別命名為核酸提取儀A、核酸提取儀B、核酸提取儀C、核酸提取儀D；4臺熒光定量PCR儀分別命名為熒光定量PCR儀1、熒光定量PCR儀2、熒光定量PCR儀3、熒光定量PCR儀4；使用配套的核酸提取試劑和擴增試劑。

2 性能驗證參數(shù)

2.1方法符合率 選取陰性標本5例和陽性樣本(宜包含弱陽性的標本)10例，與參比方法進行比較，計算其符合率,應(yīng)符合廠商試劑盒說明書中聲明的標準。

2.2精密度

2.2.1批內(nèi)精密度 取2份標本，1份陰性，1份弱陽性，兩份標本各重復(fù)檢測20次，記錄陽性標本的CT值，并計算其變異系數(shù)(CV),應(yīng)符合廠商試劑盒說明書中聲明的標準。

2.2.2批間精密度 取2份標本，1份陰性，1份弱陽性，兩份標本每天各重復(fù)檢測4次，連續(xù)檢測5 d，共計20次，記錄陽性標本的CT值，并計算其CV,應(yīng)符合廠商試劑盒說明書中聲明的標準。

2.3檢出限 使用定值標準物質(zhì)的標本，梯度稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，重復(fù)測定5次，必須100%檢出靶核酸。

3 設(shè)計的三套性能驗證方案

3.1方案一 將1臺核酸提取儀和1臺熒光定量PCR儀綁定在一起作為一套系統(tǒng)，共驗證4套檢測系統(tǒng)的方法符合率、精密度和檢出限，見圖1。

圖1 性能驗證方案一流程圖

3.2方案二 按照排列組合的原理，將4臺核酸提取儀和4臺熒光定量PCR儀的16種組合形式均做一次性能驗證，共驗證16套檢測系統(tǒng)的方法符合率、精密度和檢出限，見圖2。

圖2 性能驗證方案二流程圖

3.3方案三 (1)在核酸提取儀A上提取核酸后，分別在熒光定量PCR儀1、熒光定量PCR儀2、熒光定量PCR儀3和熒光定量PCR儀4上擴增檢測，主要驗證4臺熒光定量PCR儀的方法符合率、精密度和檢出限；(2)在核酸提取儀A、核酸提取儀B、核酸提取儀C、核酸提取儀D上分別提取核酸后，均在熒光定量PCR儀1上擴增檢測，主要驗證4臺核酸提取儀的方法符合率、精密度和檢出限。見圖3。

圖3 性能驗證方案三流程圖

4 三套方案的比較

對三套性能驗證方案進行比較，見表1、2。

表1 三套性能驗證方案的比較

表2 三套性能驗證方案優(yōu)缺點比較

5 小 結(jié)

目前通用的新型冠狀病毒核酸檢測流程均包括核酸提取和PCR擴增兩個步驟，檢測系統(tǒng)包括核酸提取試劑、核酸提取儀、核酸擴增試劑和熒光定量PCR儀四個部分，在進行性能驗證時，應(yīng)確保覆蓋到所有部分；而在實際性能驗證工作中，對核酸提取儀的驗證往往被忽略。核酸提取儀有分液、加熱、磁吸、震蕩和排風等功能，在核酸提取過程中，這些功能對提高核酸提取效率有非常重要的作用，工作人員在做性能驗證時應(yīng)引起重視。本課題組根據(jù)核酸提取儀和熒光定量PCR儀的不同組合，設(shè)計出了三套性能驗證方案。

以配置4臺核酸提取儀和4臺熒光定量PCR儀為例，通過對三套性能驗證方案的比較分析，筆者認為方案三最優(yōu)。首先，在1臺核酸提取儀上提取核酸，分別在4臺熒光定量PCR儀上擴增檢測，驗證了4臺熒光定量PCR儀的性能；然后，分別在4臺核酸提取儀上提取核酸，在同一臺熒光定量PCR儀上擴增檢測，驗證了4臺核酸提取儀的性能；達到了16套組合檢測系統(tǒng)的驗證效果，保證了新型冠狀病毒核酸檢測的質(zhì)量，試劑消耗和時間成本適中，可以有效、經(jīng)濟、快速地評估各性能參數(shù)是否符合廠商的聲明。該性能驗證方案可以推廣，供其他實驗室參考。