高通量測序用于結核病診斷的研究進展

王 璽 綜述，蘭 箭 審校

重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶 400000

結核病是結核分枝桿菌感染所致的疾病，人型結核菌為人類主要致病型。結核分枝桿菌可以感染機體除毛發、指甲以外的任何部位，其中以肺部感染最常見。結核病位列全球第13大死因，據《2021全球結核病報告》顯示，2020年全球結核潛伏感染人群接近20億，新發患者987萬，發病率為127/10萬；我國估算的新發患者數為84.2萬，發病率為59/10萬，在30個結核病高負擔國家中我國高居第2位，僅次于印度[1]。目前結核病的輔助診斷方法很多，涉及病原學、影像學、分子生物學、免疫學以及病理學等，但診斷效能欠佳。結核菌培養是確診結核病的金標準，但靈敏度僅為45%～60%[2-4]，臨床診斷往往需要聯合多種方法進行檢測分析，并常常采取診斷性抗生素治療方式來輔助臨床判斷，導致結核病診斷的延誤和治療的延后，因此提高檢測方法的靈敏度和特異度對結核病的防控意義重大。NGS采用基因測序方法能快速檢出病原微生物，本文就NGS應用于結核病診斷的研究進展進行綜述。

1 NGS概述

基因組測序共經歷了三代技術發展。一代測序的優點是準確度高、容易掌握，缺點是耗時長、過程復雜、費用高。二代測序，也就是NGS，它以循環微陣列法為原理，包括樣本處理、核酸提取、基因文庫生成和生物信息學途徑分析幾個步驟[5]。NGS一次能對高達幾百萬條的DNA分子測序，使物種的基因組或轉錄組測序變得容易。NGS用于病原學的檢測包括靶向下一代測序(tNGS)、宏基因組下一代測序(mNGS)、全基因組測序(WGS)等。tNGS是對富集后的目的DNA序列進行高通量測序，只能用于核酸序列已知的病原體的檢測；mNGS是直接提取樣本中全部微生物群落基因的DNA進行測序，理論上一次性可以檢出全部的微生物序列；WGS是對整個基因組進行檢測，可以檢測編碼區、非編碼區、調控區，以及一些結構變異。相對于一代測序，NGS的準確性略有降低，但通量高、耗時短、成本低，更適用于臨床使用。三代測序是以單分子測序技術為基礎的新一代測序方式，不需要經過PCR擴增，主要分為單分子熒光測序技術和納米孔測序技術，近年來三代測序逐漸控制了成本，但在精度上仍需進行更多的研究與驗證[6-7]，目前較少應用于臨床。

NGS包括DNA測序和RNA測序，DNA測序可檢測除RNA病毒以外的病原微生物，RNA測序可檢測RNA病毒，同時還可以反映病原微生物轉錄活性[8]。mNGS可以檢測來自人類、動物、食品和環境的各種標本，在不預先了解病原體類型的情況下能直接檢出所有微生物序列，包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲。由于不同病原微生物有不一樣的生長條件，常規的標準培養往往不能培養出標本中的所有病原微生物，所以NGS將來有可能成為微生物實驗室的主導技術[9-10]。NGS還能對艾滋病、結核病、流感、脊髓灰質炎、瘧疾等傳染性疾病進行監測[11-12]。多項研究指出，在感染性疾病中mNGS的靈敏度高于傳統培養法[13-14]，尤其是用于血液、支氣管肺泡灌洗液和痰液標本的檢測[15]。在肺部感染性疾病的病原學檢測中，NGS比傳統方法檢測范圍更廣、檢出率更高、耗時更短，且能明顯提高了真菌感染的診斷率[16-18]。相較于普通病原菌，結核分枝桿菌更難培養，因此NGS用于檢測結核分枝桿菌的檢測是極具前景的。

2 常用的結核病檢測方法

目前關于結核病的檢測方法很多，包括涂片法、培養法、病理活檢、影像學檢查以及結核分枝桿菌核酸檢測、純化蛋白衍生物(PPD)試驗、γ干擾素釋放試驗(IGRA)、結核抗體檢測等，確診結核病常常需要上述檢測方法的聯合使用[19]。

涂片法的依據是結核分枝桿菌的抗酸特性，是指將樣本進行涂片、染色，根據染色情況判定結果。該法簡便、快捷，但靈敏度受樣本質量的影響大，且不能鑒別結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌[20]。培養法特異度高，但由于結核分枝桿菌生長緩慢，不管是羅氏固體培養基(2～4周)還是改良液體培養基(1～2周)，都無法避免培養周期長的問題，不能快速得到結果[19]。陽性培養標本還需要進一步進行耐藥表型分析，即結核分枝桿菌藥敏試驗(DST)，以了解結核分枝桿菌是否存在耐藥，但需耗時2～4周。在結核病高負擔國家，培養法的低效能限制了其在早期診斷中的臨床應用[12]。病理活檢也是診斷結核病的方法之一，結核病的病理改變表現為上皮細胞樣肉芽腫性炎，光學顯微鏡下可見大小不等、數量不同的壞死性和非壞死性的肉芽腫，同時需要在病變區找到病原菌，并采用抗酸染色方法來確定[19]。但部分患者活檢難度大，且增加了診治風險，從而限制了臨床上的廣泛開展。胸部X片是臨床篩查肺結核的最常用方法，但容易漏檢，相比之下，胸部CT可以發現更小、更隱匿的病灶。肺結核病灶具有多形性的特點，容易出現空洞、硬結及鈣化灶，常位于上葉尖后段及下葉背段，但影像學不典型者也并非罕見，常常需要與其他病原菌感染相鑒別，因此影像學檢查只能作為診斷結核的輔助證據。

核酸檢測技術的發展在一定程度上彌補了傳統病原學檢查的局限性，靈敏度和特異度均有所提高。常用方法包括聚合酶鏈式反應(PCR)、環介導等溫擴增反應(LAMP)、利福平耐藥快速檢測(Xpert MTB/RIF)等。LAMP無法對檢測結果進行耐藥性判斷[21]，而Xpert MTB/RIF可同時用于結核病的診斷和耐利福平結核菌的判斷[1]。LAMP與Xpert MTB/RIF在結核病的診斷中有較好的一致性，明顯優于涂片法[22-23]；在臨床診斷患者中，兩者靈敏度與培養法接近，特異度高于培養法；但在有抗結核活性藥物暴露史的患者中，兩者靈敏度優于培養法[22]。抗結核藥物通過抑制細胞壁、蛋白質、酶的合成等原理降低結核分枝桿菌菌株活性[24-27]，而核酸可以較長時間保留在死亡菌株中，同時也說明分子生物學方法不能替代結核菌培養用于藥物療效監測。由于LAMP操作簡單、成本低，當Xpert MTB/RIF由于條件限制不能開展時，LAMP可以取代涂片顯微鏡檢查，提高結核病診斷能力[22]。此外，核酸檢測技術還應用于耐藥結核的基因型分析，包括基于反向雜交的線探針分析(LPA)和半定量Xpert MTB/RIF[28]，但臨床上的應用不如表型分析廣泛。

結核分枝桿菌感染人體后會發生一系列免疫反應，基于此的檢驗方法有PPD試驗和IGRA。PPD試驗是基于Ⅳ型超敏反應的皮膚試驗，根據硬結及水泡的情況在試驗后72 h判定結果，該法干擾因素較多，有出現假陽性或假陰性可能，且不能區分活動性感染與潛伏感染，靈敏度較低。IGRA包括結核菌感染T細胞斑點試驗(T-SPOT)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)，它們都有很高的靈敏度，且T-SPOT法特異度稍高于ELISA法，且同樣不能區分活動性感染與潛伏感染[29]。血清結核分枝桿菌抗體在體內存在時間很長，即使結核病痊愈后仍可以檢測到，盡管檢測敏感度在70%左右，但并不能作為判斷結核病活動性的指標[30]。

3 NGS在結核病診斷中的應用

3.1NGS檢測結核分枝桿菌 多項研究報道，NGS檢測結核分枝桿菌的特異度高達98%以上，而靈敏度明顯優于傳統培養法和Xpert MTB/RIF[31-33]。NGS在不同部位來源的樣本檢測中也存在差異，肺樣本的檢測靈敏度明顯高于肺外樣本，分別為58.5%和43.1%；痰液檢測靈敏度為52.3%，略低于培養法的60.9%；但在培養陰性的支氣管肺泡灌洗液和漿膜腔液體樣本中，NGS陽性檢出率仍有28.8%，提示NGS有利于菌陰結核病的診斷[32]，且NGS對肺外結核的診斷效率仍高于傳統培養法和Xpert MTB/RIF[32-36]。NGS檢測需要32～36小時，液體培養基培養法需要14～55天，雖然涂片法只需1～2天，但它的靈敏度及特異度均不如NGS，因此NGS有利于活動性肺結核的早期診斷[32]。

WGS通過檢測單核苷酸多態性(SNP)的多寡，可以用來評估和鑒別結核病患者是否合并感染、復發或者再感染。如果變量位置顯示具有不同等位基因的群體共存，則可以在大量測序數據中檢測到合并感染[37-38]。對復發結核患者前后兩次的標本進行檢測，也可判斷是復發還是再次感染。一項摩爾多瓦的研究對患者進行基因測序顯示，在多個耐藥結核樣本之間的SNP差異不超過10個，從基因層面證實了人與人之間的傳播[39]。痰液和支氣管肺泡灌洗液都可以作為NGS檢測的樣本，但痰液更容易被污染，在變異分析中會引入更大的偏差，出現不真實的SNP。對于痰稀少的疑似肺結核病例，支氣管肺泡灌洗液或肺組織是更好的結核分枝桿菌檢測標本，但這類標本都包含大量的人類基因，需進行嚴格的質量控制以減少宿主基因組的影響[40]。由于部分標本的黏液含量高，結核分枝桿菌可能發生聚集而分布不均，導致結核菌計數不準確，因此樣本需要預處理，通過耗盡其他細胞DNA來均化和富集結核桿菌，以提高NGS診斷率[41]。除此之外，抗結核治療會顯著降低NGS的檢出率，這提示NGS樣本需要在經驗性治療前收集，并且樣本如果在檢測或運輸過程中被污染同樣會降低NGS診斷率[33-34]。另外，由于結核分枝桿菌是胞內菌，體液中的病原體含量較少，在檢測過程中需對細胞進行破壁處理，這可能會破壞遺傳物質，導致檢出率降低。

3.2NGS對耐藥結核菌的識別 結核病疫情難控制的原因和耐藥菌株的增加密切相關，耐藥結核患者數量增加的主要原因是不適當的治療和耐藥結核分枝桿菌分離株的社區傳播。在基因組水平上，結核分枝桿菌的耐藥性是由單個或多個結核分枝桿菌基因的遺傳變異造成的。NGS用于鑒別結核分枝桿菌分離株的分子分型技術，有基于IS6110的限制性片段長度多態性分析(IS6110-RFLP)、分枝桿菌散布重復單位-可變數目串聯重復序列測定(MIRU-VNTR)、WGS等。IS6110-RFLP分型在20世紀90年代是公認的結核病基因分型的金標準[42]，但它費力耗時，對操作人員要求高，而且對IS6110拷貝數在5個或以下的菌株沒有足夠的分辨能力[43]。2009年歐洲疾病預防和控制中心(ECDC)提出將MIRU-VNTR作為結核病基因分型的金標準。MIRU-VNTR分型結果格式簡單，以DNA擴增為基礎，不需要對結核分枝桿菌進行培養，并縮短了實驗室檢測時間[44]。2019年，ECDC提議在一些優先病原體的監測和暴發調查中使用WGS。一項評估WGS在實驗室診斷分枝桿菌性能的研究顯示，93%的分枝桿菌與常規實驗室鑒定結果一致，93%的結核分枝桿菌復合群藥敏預測與DST結果相符合[45]。WGS用于分子分型可獲得高分辨能力的精確遺傳信息，但目前微生物數據庫尚缺乏廣度和精度，且沒有統一的解讀標準，因此普及推廣面臨著挑戰[43,46]。

由于結核病耐藥是由結核分枝桿菌基因突變引起的，因此使用NGS進行耐藥監測有很大優勢。NGS的成本與DST相當，且耗時短，它可以識別所有可能導致耐藥的突變，不管是已知的還是未知的，同時還可以區分改變表型的耐藥突變和不改變表型的沉默突變[28,41,47]。在利福平耐藥的檢測上，Xpert MTB/RIF檢測耐利福平結核菌的特異度(99.5%)比NGS高，但靈敏度較低(61.8%)[34]。一項研究采用NGS檢測了1000多份痰菌陽性樣本，發現結核病患者對利福平、氟喹諾酮、吡嗪酰胺的耐藥率低，但對利福平敏感患者對異煙肼的耐藥率較高。如果使用Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性，將導致漏診很多耐異煙肼結核病患者[34]。這也說明了傳統的分子技術不足以評估全部的耐藥突變，需要進行多重分析。NGS檢測一線抗結核藥物和部分二線抗結核藥物耐藥性的準確率很高[48]，表型結果與基因型結果的一致性較好，但由于抗藥性遺傳基礎不完全清楚，故基因型方法還不能完全取代傳統的表型方法[12,48-49]。有報道分析了88株再培養的耐多藥肺結核病(MDR-TB)菌株，比較NGS和一代測序對于吡嗪酰胺耐藥的突變檢測，兩者結果符合率為89%，NGS不僅證實了一代測序檢測到的吡嗪酰胺耐藥的主要突變基因，即pncA基因，還發現了幾個新的混合菌株突變，解決了部分基因型與表型結果不一致的問題[50]。隨著NGS更多應用于結核病的耐藥性檢測，以及基因序列數據信息的不斷補充和完善，NGS有望用于結核病耐藥的定量解釋，以指導制定后續治療方案[51]。與DST相比，WGS可以了解不同地區的結核分枝桿菌耐藥模式和在傳播過程中不斷獲得的耐藥性信息，這更有利于結核病疫情的控制[52]。

4 總結和展望

我國是結核病高負擔國家，由于傳統檢測方法的局限性，結核病的早期診斷和防控仍面臨很大挑戰。NGS檢測特異度高，且靈敏度高于培養法和Xpert MTB/RIF，能快速檢測樣本中所有的微生物序列，在結核病的早期診斷和鑒別診斷上有很大的價值。NGS可以對多種樣本進行檢測，對肺結核和肺外結核的診斷都有很大幫助；同時還能鑒別結核患者是合并感染、復發或者再感染；能識別所有可能導致耐藥的突變，確定耐藥菌株的傳播模式，有利于阻斷結核病的傳播。

目前NGS缺乏全面且高精度的數據庫，對檢測出的基因閾值不能進行量化分級，對檢測結果沒有統一的解讀標準，對操作沒有統一的流程，這些都是NGS廣泛推行面臨的問題。雖然NGS在結核菌感染中的研究日益增多，但高中低風險區都缺乏多中心和大規模的前瞻性研究，使其診斷效能和可信度都大打折扣。NGS是醫學、分子生物學、生物信息學等多學科發展進步的成果，目前用于結核病的早期診斷和耐藥結核的鑒定還欠成熟，其發展和完善還需要多學科的共同努力和協作。