一種全自動陰道分泌物檢測儀的性能評價與分析*

羅燕萍，劉麗亞，張秀明，蔡珠妹，莫紅梅

深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，廣東深圳 518001

陰道分泌物由陰道黏膜滲出物、宮頸腺體、前庭大腺及子宮內(nèi)膜分泌物組成，含陰道上皮脫落細(xì)胞、白細(xì)胞等，俗稱“白帶”。陰道分泌物檢查是婦科最常用、最基本的實驗室檢查項目，其檢查結(jié)果對診斷生殖系統(tǒng)感染、腫瘤等有一定的參考價值[1]。傳統(tǒng)的陰道分泌物檢查主要是通過生理鹽水涂片進(jìn)行人工顯微鏡檢查，其結(jié)果的準(zhǔn)確性仍依賴于檢驗人員的經(jīng)驗和技術(shù)能力，同時也存在靈敏度、特異度以及主觀誤差性大的嚴(yán)重問題。為此，本科室引入了使用人工智能深度學(xué)習(xí)DeepCell引擎的全自動陰道分泌物檢測儀，并參照《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在體液學(xué)檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[2]，中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T-0996-2015：尿液有形成分分析儀(數(shù)字成像自動識別)[3]、YY/T0475-2011：干化學(xué)尿液分析儀[4]，以及中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T-505-2017：定性測定評價指南[5]中的要求，參考全自動尿液分析儀性能評價相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]對其進(jìn)行性能評價，評價其基于人工智能算法的檢測系統(tǒng)的基本性能及與人工顯微鏡檢、參考儀器檢測結(jié)果的一致性。

1 資料與方法

1.1一般資料 陰道分泌物標(biāo)本來源于本院的門診、住院患者及于本院進(jìn)行體檢的成年女性患者，排除外觀為血性或有明顯陰道用藥的標(biāo)本。標(biāo)本由婦科醫(yī)生采集，采集后的棉拭子放入潔凈無菌的試管中送檢。

1.2儀器和試劑 實驗儀器為深圳市瑞圖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的RT-F600全自動陰道分泌物檢測儀(以下簡稱RT-F600)，試劑為儀器配套的RT-F600A陰道炎聯(lián)合檢測試劑盒和質(zhì)控品。參考儀器為鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的全自動生殖道分泌物工作站AutowoMO(以下簡稱安圖)，試劑為其配套的陰道炎五聯(lián)檢測試劑盒，人工鏡檢使用的是日本Olympus公司的CX31型光學(xué)顯微鏡。

1.3方法

1.3.1驗證項目 本研究參考陰道分泌物分析儀性能評價相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]結(jié)合本實驗室實際情況，對RT-F600的檢測重復(fù)性、攜帶污染率、自動稀釋功能、與人工鏡檢的一致性、干化學(xué)項目陰陽符合率、檢出限、與參考儀器干化學(xué)項目檢測的一致性進(jìn)行驗證。

1.3.2儀器檢測重復(fù)性驗證 選取陰道分泌物標(biāo)本20例(包括真菌陽性、細(xì)菌陰道病陽性標(biāo)本)充分混合均勻，分裝到20個標(biāo)本管中，按常規(guī)方法上機(jī)連續(xù)檢測20次，評價儀器的重復(fù)性；形態(tài)學(xué)指標(biāo)驗證通過標(biāo)準(zhǔn)：清潔度結(jié)果應(yīng)無差異或浮動不超過一個等級，真菌、滴蟲、線索細(xì)胞及菌絲的符合率≥90%；干化學(xué)項目的驗證通過標(biāo)準(zhǔn)：脯氨酸氨基肽酶(PIP)、唾液酸苷酶(SNA)、白細(xì)胞脂酶(LE)、乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、過氧化氫(H2O2)符合率≥90%，pH值重復(fù)性檢測結(jié)果變異系數(shù)(CV)≤5%。

1.3.3攜帶污染率驗證 選擇10例陰道分泌物標(biāo)本與稀釋液(空白樣本)按常規(guī)檢測方法交替檢測，記錄其結(jié)果。攜帶污染率驗證通過標(biāo)準(zhǔn)：空白標(biāo)本檢測結(jié)果為陰性。清潔度I～Ⅱ度為為陰性，Ⅲ～Ⅳ度為陽性。

1.3.4自動稀釋功能驗證 根據(jù)目視觀察的結(jié)果，選擇10例高濃度標(biāo)本進(jìn)行測試，觀察系統(tǒng)是否提示樣本濃度過高，檢測完成后查看測試結(jié)果是否有稀釋標(biāo)志。評價標(biāo)準(zhǔn)：系統(tǒng)提示樣本濃度過高，測試結(jié)果有“*2”標(biāo)注并自動糾正。驗證通過標(biāo)準(zhǔn)為符合率≥90%。

1.3.5與人工鏡檢的一致性驗證 選取412例陰道分泌物標(biāo)本，按儀器使用要求進(jìn)行檢測后，剩余標(biāo)本交由實驗工作人員嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版[11]要求進(jìn)行涂片人工鏡檢。鏡檢項目包括清潔度、真菌、線索細(xì)胞、滴蟲及菌絲，統(tǒng)計儀器鏡檢結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果的總符合率、假陰性率及一致性。由于清潔度的判讀是根據(jù)白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、乳酸桿菌和球菌的多少來進(jìn)行分級，參照《尿液有形成分分析儀(數(shù)字成像自動識別)》中關(guān)于細(xì)胞識別率的要求以及《臨床微生物檢驗程序驗證指南》[12]中關(guān)于細(xì)菌的顯微鏡檢查評價方法。驗證通過標(biāo)準(zhǔn)：清潔度總符合率≥80%，真菌、線索細(xì)胞、滴蟲、菌絲總符合率≥90%，假陰性率≤5%。

1.3.6干化學(xué)項目陰性符合率和陽性符合率驗證 按照瑞圖陰道炎聯(lián)合檢測試劑盒質(zhì)控品說明書要求，隨機(jī)抽取不同批次干化學(xué)檢測試劑卡20塊，分別用陰性參考品與陽性參考品按照常規(guī)方法各檢測10次，評價干化學(xué)項目(PIP、SNA、LE、NA、H2O2)的陰性符合率和陽性符合率。驗證通過標(biāo)準(zhǔn)：陽性參考品檢測結(jié)果不能為陰性，陰性參考品結(jié)果不能為陽性，符合率≥90%。

1.3.7干化學(xué)項目檢出限驗證 隨機(jī)抽取不同批次干化學(xué)檢測試劑卡20塊，根據(jù)瑞圖RT-F600A陰道炎聯(lián)合檢測試劑盒質(zhì)控品說明書配備干化學(xué)項目檢出限附近濃度的參考品(濃度:PIP 0.5 U/mL，SNA 8U/L，LE 65 U/L，NAG 145 U/L，H2O22 μmol/L)，分別檢測20次，評價干化學(xué)的檢出限。觀察檢測結(jié)果是否為陽性，驗證通過標(biāo)準(zhǔn)：各項目符合率≥90%。

1.3.8干化學(xué)項目一致性驗證 選取81例陰道分泌物標(biāo)本，分別用RT-F600A、安圖進(jìn)行檢測，記錄各項目的檢測結(jié)果并統(tǒng)計總符合率、假陰性率及一致性。驗證通過標(biāo)準(zhǔn)：總符合率≥90%，假陰性率≤5%。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用Kappa一致性檢驗來評價RT-F600A與人工鏡檢、RT-F600A與安圖檢測結(jié)果的一致性。Kappa>0.8表明有很好的一致性；0.6

2 結(jié) 果

2.1儀器重復(fù)性驗證 20次重復(fù)性檢測中，清潔度、真菌、滴蟲、線索細(xì)胞、PIP、SNA、LE、NAG、H2O2的結(jié)果均完全一致；菌絲除2例為陰性外，其余均為陽性；pH的檢測值除1例為4.6外，其余均在4.4～4.5。清潔度、真菌、滴蟲、線索細(xì)胞的重復(fù)性結(jié)果符合率為100.00%，菌絲為90.00%；干化學(xué)項目(PIP、SNA、LE、NAG、H2O2檢測)的重復(fù)性符合率均為100.00%；pH值重復(fù)性檢測的CV為1.36%，小于5.00%；驗證通過。

2.2攜帶污染率驗證 10例空白標(biāo)本清潔度、真菌、滴蟲、線索細(xì)胞、PIP、SNA、LE、NAG、H2O2的檢測結(jié)果均為陰性，攜帶污染率驗證通過。

2.3自動稀釋功能驗證 10例高濃度樣本經(jīng)上機(jī)測試，儀器均提示“樣本濃度過高”，測試結(jié)果均顯示有“*2”標(biāo)注并進(jìn)行了自動糾正,符合率為100.00%，驗證通過。

2.4與人工鏡檢的一致性 儀器檢測與人工鏡檢結(jié)果進(jìn)行比較：清潔度、真菌、線索細(xì)胞、滴蟲、菌絲的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；真菌、滴蟲的Kappa值>0.8,表示兩種方法有很好的一致性；清潔度的Kappa值為0.6～0.8，表示兩種方法有較高的一致性；線索細(xì)胞的Kappa值為0.4～0.6，表示兩種方法的一致性一般；菌絲的Kappa值<0.4，表示兩種方法一致性較差。清潔度的假陰性率為18.20%，菌絲的假陰性率為6.07%。見表1。

表1 RT-F600與人工鏡檢符合率驗證結(jié)果(n=412)

2.5干化學(xué)項目陰性符合率和陽性符合率 陰性參考品在10次檢測中干化學(xué)項目結(jié)果均為陰性，陽性參考品10次檢測各項目結(jié)果均為陽性，陰性符合率和陽性符合率均為100.00%，驗證通過。

2.6干化學(xué)項目檢出限 PIP的檢出限(0.5 U/mL)符合率為90.00%，SNA(8U/L)、LE(65 U/L)，NAG(145 U/L)、H2O2(2 μmol/L)檢出限符合率均為100.00%，驗證通過。

2.7與參考儀器干化學(xué)項目檢測的一致性 RT-F600與安圖進(jìn)行比較，PIP、SNA、LE、NAG、H2O2的檢測結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。一致性檢驗顯示：SNA和LE的Kappa值分別為0.685和0.791，表明兩種方法有較高的一致性；NAG的Kappa值為0.584，表明兩種方法一致性一般；H2O2、PIP的Kappa值均小于0.4，表明兩種方法的一致性較差。見表2。

表2 RT-F600干化學(xué)項目一致性驗證結(jié)果(n=81)

3 討 論

陰道炎作為婦科門診中最常見及復(fù)發(fā)率最高的疾病，它嚴(yán)重威脅著婦女的身心健康，對其工作和生活造成影響[13]。陰道分泌物有形成分主要包括白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、線索細(xì)胞、桿菌和真菌等，對陰道分泌物進(jìn)行檢測具有非常重要的臨床意義。隨著標(biāo)本量的劇增，人工鏡檢已不能滿足日益增長的檢測需求，擁有一套能自動檢測且精度高的檢測識別系統(tǒng)尤為重要。近年來，有許多的檢測識別算法應(yīng)用于臨床，例如馬麗文[14]提出了一種對婦科分泌物顯微圖像中各成分進(jìn)行自動檢測的識別算法；PRINYAKUPT等[15]利用線性和樸素貝葉斯分類器對血涂片顯微圖像中白細(xì)胞的自動檢測和分類進(jìn)行了研究，這些算法對婦科陰道分泌物細(xì)胞的檢測精度依舊不高。本研究中使用的RT-F600是基于人工智能DeepCell引擎開發(fā)的一套針對細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行高精度識別的系統(tǒng)，包括形態(tài)學(xué)和干化學(xué)檢測兩部分，檢測過程全流程自動化、智能化，無需檢測人員手工進(jìn)行涂片、顯微鏡檢、干化學(xué)檢測等一系列繁瑣操作，大幅度提高了檢測人員的工作效率，同時也能避免人工操作時致病菌對實驗室造成生物污染。本課題組對RT-F600的重復(fù)性、攜帶污染率、自動稀釋功能、與人工鏡檢的一致性、干化學(xué)項目的陰性符合率和陽性符合率、檢出限、與參考儀器檢測結(jié)果的一致性進(jìn)行了評價，各項指標(biāo)性能良好。

由于國內(nèi)目前尚沒有全自動陰道分泌物檢測儀性能評價的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)學(xué)部分的重復(fù)性、攜帶污染率及儀器識別準(zhǔn)確率參考了中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T-0996-2015：尿液有形成分分析儀(數(shù)字成像自動識別)[3]。本次性能評價試驗中，儀器重復(fù)性、攜帶污染率符合率均≥90.00%，驗證通過。真菌、線索細(xì)胞、滴蟲及菌絲的儀器鏡檢識別總體符合率結(jié)果≥90.00%，高于標(biāo)準(zhǔn)YY/T-0996-2015中對尿液中識別率要求最高的白細(xì)胞評估標(biāo)準(zhǔn)(≥80.00%)。由于清潔度Ⅰ和Ⅱ度表示正常，Ⅲ和Ⅳ度表示有陰道炎癥，所以將Ⅰ和Ⅱ度合并為陰性，Ⅲ和Ⅳ度合并為陽性，而《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版中關(guān)于清潔度的分級標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)桿菌、球菌、上皮細(xì)胞及白細(xì)胞的數(shù)量多少進(jìn)行分級，對于檢出少量真菌孢子而白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、桿菌及球菌數(shù)量正常的標(biāo)本，儀器報告清潔度為陰性，而人工鏡檢由于主觀因素等原因會報告陽性，同時對于桿菌、球菌、上皮細(xì)胞及白細(xì)胞的數(shù)量處于臨界值的標(biāo)本，儀器結(jié)果與人工結(jié)果會有一定的差異，這導(dǎo)致了清潔度的總體符合率(80.30%)及假陰性率(18.20%)相對于其他形態(tài)學(xué)項目而言略差，但仍高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(≥80.00%)，且Kappa值為0.617，提示兩種方法間有較高的一致性，驗證符合要求。由于標(biāo)本中細(xì)胞及病原體并非完全均勻分布于整個涂片,鏡檢視野的選擇會影響細(xì)胞數(shù)目及病原體的鏡檢檢出率[16]；儀器默認(rèn)只隨機(jī)拍攝10個視野圖片，視野過少可導(dǎo)致部分?jǐn)?shù)量較少的病原體(如菌絲)漏檢，當(dāng)涂片中菌絲與上皮細(xì)胞稍有重疊時儀器無法自動識別出菌絲而不能分類，這也是導(dǎo)致菌絲假陰性率(6.07%)過高及一致性較差(Kappa值為0.183)的原因，在實際檢測過程中需要檢驗人員對不能分類的圖片進(jìn)行瀏覽、篩查，并對可疑標(biāo)本通過顯微鏡鏡檢確認(rèn)后進(jìn)行最后的結(jié)果修正。對于濃度高的陰道分泌物標(biāo)本，因細(xì)胞分層會存在有的細(xì)胞清晰而有的細(xì)胞模糊，導(dǎo)致細(xì)胞無法識別的問題，本研究中10例高濃度樣本檢測時系統(tǒng)均有異常提示，結(jié)果中均進(jìn)行了糾正。線索細(xì)胞是由于大量的陰道加德納菌或小桿菌等覆蓋于陰道鱗狀上皮細(xì)胞表面，使細(xì)胞邊緣模糊粗糙，呈顆粒狀或云霧狀，通過線索細(xì)胞檢查診斷細(xì)菌性陰道炎已經(jīng)在臨床上獲得了廣泛性認(rèn)可[17]，在部分溶細(xì)胞性陰道病的陰道分泌物中，大量的革蘭陽性乳桿菌形態(tài)細(xì)菌覆蓋破碎的上皮細(xì)胞，其形態(tài)和線索細(xì)胞相似，被稱為“假線索細(xì)胞”[18-19]，儀器會把這類細(xì)胞錯誤分至線索細(xì)胞欄目中，這是導(dǎo)致線索細(xì)胞儀器鏡檢與人工鏡檢兩種方法間一致性一般(Kappa為0.595)的原因，但其總符合率≥90.00%，驗證符合要求。

干化學(xué)功能酶檢測主要通過檢測PIP、SNA、LE、NAG、H2O2等與致病因素相關(guān)的酶類對陰道疾病做出診斷，可提高陰道疾病診斷的特異度，具有快速、簡單、指標(biāo)客觀的優(yōu)點(diǎn)[20]。H2O2是陰道中有益乳酸桿菌特別是產(chǎn)生H2O2的乳酸桿菌的一種代謝產(chǎn)物，其濃度的高低是評價乳酸桿菌功能的重要指標(biāo)[10]。LE是白細(xì)胞膜上的一種蛋白質(zhì)，炎癥感染時多核型白細(xì)胞由于趨化作用在炎癥灶聚集而釋放大量白細(xì)胞脂酶，并通過陰道上皮細(xì)胞黏膜滲透到分泌物中，其活性的高低與多核型白細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。PIP可由多種厭氧細(xì)菌和真菌產(chǎn)生，也是動彎桿菌、大部分加德納菌和假絲酵母菌的特異性酶。SNA又稱神經(jīng)氨酸苷酶,在陰道微生態(tài)微生物群中，普雷沃菌、類桿菌和部分加德納菌是使SNA活性增加的主要病原菌,測定陰道分泌物中的SNA活性可以輔助診斷由以上菌群引起的細(xì)菌性陰道病。NAG是滴蟲具有的一種特異性酶，可通過檢測NAG活性水平來診斷滴蟲性陰道炎[21]。本次性能評價中，干化學(xué)項目的重復(fù)性驗證符合率為100%，表明儀器穩(wěn)定性良好；10例空白樣本的結(jié)果均為陰性，提示檢測過程中本底干擾及交叉污染可忽略，表明儀器的沖洗性能好，攜帶污染率驗證通過；檢出限中除PIP(0.5 U/mL)符合率為90.00%外，其余項目檢出限符合率均為100.00%，表明儀器有較高靈敏度。由于方法學(xué)及酶特異性的局限性，目前國內(nèi)尚沒有陰道分泌物干化學(xué)功能酶相關(guān)指標(biāo)檢測的室間質(zhì)評物，本文使用陰性參考品與陽性參考品進(jìn)行干化學(xué)項目的陰陽符合率驗證，各項目的符合率均為100.00%，表明儀器干化學(xué)結(jié)果有較高的準(zhǔn)確性。在檢驗結(jié)果的一致性方面，通過與已上市的安圖陰道五聯(lián)檢試劑盒干化學(xué)項目進(jìn)行比對，H2O2、PIP一致性不佳(Kappa分別為0.296和0.388)，不能單獨(dú)作為診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，需結(jié)合形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果共同判斷；總符合率方面，除H2O2總符合率(70.37%)略低外，其余項目總符合率均≥90.00%，能滿足臨床需求。

綜上所述，RT-F600性能良好，檢測速度較快，圖像顯示清晰，細(xì)胞分類標(biāo)識較準(zhǔn)確，能快速識別病原體，聯(lián)合干化學(xué)功能酶學(xué)檢測可用于臨床陰道炎癥相關(guān)疾病的篩查，能降低人工鏡檢的工作負(fù)荷，具有較好的臨床應(yīng)用價值，但對于部分標(biāo)本仍需要人工鏡檢確認(rèn)，檢驗人員形態(tài)學(xué)水平的提高仍然很重要[22]。自動化的檢測儀器在未來還需要進(jìn)一步優(yōu)化算法及升級版本以拍攝更多視野，提高各項指標(biāo)檢測的準(zhǔn)確性。