環(huán)狀RNA circCDYL對(duì)肝細(xì)胞癌遷移和侵襲的影響

王海雨，王 然

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，江蘇淮安 223001

超過(guò)90%的人類轉(zhuǎn)錄體不具備蛋白質(zhì)編碼能力，但可以轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(ncRNA)，包括微小RNA(miRNA)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)[1]。circRNA由前體mRNA反向剪接而成，具有環(huán)形共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)，對(duì)核酸外切酶的耐受性更高，因而具有更高的穩(wěn)定性[2]。研究人員已在各種生物體中鑒定出數(shù)千種circRNAs，它們?cè)谠S多疾病(尤其是各類癌癥)中起到了關(guān)鍵作用[3-6]。circRNA通過(guò)與miRNA結(jié)合充當(dāng)“miRNA海綿”，通過(guò)影響其對(duì)目的轉(zhuǎn)錄體的降解發(fā)揮間接調(diào)控的作用。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：環(huán)狀Y樣結(jié)構(gòu)域(circCDYL)與RNA結(jié)合蛋白(RBP)的相互作用促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[7-8]。目前關(guān)于circCDYL在肝細(xì)胞癌(HCC)中的作用尚未完全闡明，故本研究探討了HCC組織及癌旁組織中circCDYL的表達(dá)差異，同時(shí)分析了HCC組織中circCDYL的表達(dá)與患者臨床資料的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響，運(yùn)用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circCDYL對(duì)HCC遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本及細(xì)胞系來(lái)源 cDNA芯片(包括90對(duì)HCC組織和癌旁組織標(biāo)本提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA)由芯超生物科技有限公司提供，包括完整的臨床/病理參數(shù)及隨訪資料，手術(shù)時(shí)間從2007年6月至2008年11月，隨訪截至2012年3月，隨訪期間死于HCC的患者32例，患者術(shù)前均未接受任何治療。4株HCC細(xì)胞(HepG2、QGY-7703、MHCC97-H、SMMC-7721)和1株正常肝臟上皮細(xì)胞(LO2)由中科院生物化學(xué)研究所(上海)提供，細(xì)胞在含有10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1circCDYL表達(dá)水平檢測(cè) 使用總RNA抽提試劑提取HCC細(xì)胞株及正常肝臟上皮細(xì)胞的RNA，之后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用qPCR試劑在伯樂(lè)T100 PCR儀上檢測(cè)細(xì)胞株和芯片中circCDYL表達(dá)水平。以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為circCDYL的內(nèi)參，測(cè)得circCDYL與GAPDH的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)，運(yùn)用2—ΔΔCt公式計(jì)算circCDYL的相對(duì)表達(dá)量。以上檢測(cè)重復(fù)5次。將90例HCC組織按circCDYL相對(duì)表達(dá)水平排序，低于中位數(shù)定義為circCDYL低表達(dá)組，高于中位數(shù)則定義為circCDYL高表達(dá)組。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 敲減circCDYL的3條小干擾RNA(siRNA)由吉?jiǎng)P基因有限公司(上海)提供。將4×105個(gè)細(xì)胞均勻鋪在6孔板中孵育，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，轉(zhuǎn)染siRNA和陰性對(duì)照序列，孵育48～72 h后收集細(xì)胞并提取RNA，檢測(cè)circCDYL的敲減效率。circCDYL、GAPDH引物及siRNA寡核苷酸序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及siRNA寡核苷酸序列

1.2.3細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) 使用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約5×105～6×105個(gè)/mL，吸取300 μL懸液加入上層小室中(侵襲實(shí)驗(yàn)在遷移實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上多鋪一層凝膠)，加入500 μL 10% FBS培養(yǎng)液在下層小室；孵育24 h，將未通過(guò)孔篩的細(xì)胞拭去，而將通過(guò)孔篩的細(xì)胞使用甲醛固定、結(jié)晶紫染色，在普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1HCC組織與癌旁組織中circCDYL表達(dá)水平的比較 HCC組織中circCDYL相對(duì)表達(dá)水平(4.01±1.63)高于癌旁正常組織(0.74±0.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.37,P<0.05)。

2.2HCC組織中circCDYL相對(duì)表達(dá)水平與患者臨床/病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性 HCC組織中circCDYL表達(dá)與HBsAg狀態(tài)、血管浸潤(rùn)、肝硬化結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、復(fù)發(fā)情況、PD-L1和CTLA-4狀態(tài)有關(guān)聯(lián)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤最大徑及血清AFP水平等均無(wú)關(guān)聯(lián)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 HCC組織中circCDYL的相對(duì)表達(dá)水平與患者臨床/病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性[n(%)]

續(xù)表2 HCC組織中circCDYL的相對(duì)表達(dá)水平與患者臨床/病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性[n(%)]

2.3circCDYL對(duì)HCC細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響 對(duì)4株HCC細(xì)胞(HepG2、QGY-7703、MHCC97-H、SMMC-7721)和1株正常肝臟上皮細(xì)胞(LO2)中circCDYL表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株HCC細(xì)胞中circCDYL相對(duì)表達(dá)水平(4.50±0.30、2.93±0.21、2.37±0.15、1.60±0.10)均高于正常肝臟上皮細(xì)胞(1.00±0.20)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。選取HepG2轉(zhuǎn)染3個(gè)siRNA用以敲減circCDYL，其中siRNA-1效果最顯著(P<0.001)，見(jiàn)圖1B。選擇siRNA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，敲減circCDYL后，HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：A為4種HCC細(xì)胞與正常肝臟上皮細(xì)胞(LO2)中circCDYL相對(duì)表達(dá)水平比較；B為HepG2細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siRNA后敲減效果的比較；***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

注：A、C表示HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-1后遷移能力明顯下降；B、D表示HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-1后侵襲能力明顯下降；***表示P<0.001；si-NC為對(duì)照；si-circCDYL為采用siRNA-1敲減circCDYL；放大倍數(shù)為100。

2.4circCDYL相對(duì)表達(dá)水平與HCC患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)性 經(jīng)生存分析，對(duì)TNMⅠ～Ⅲ期(作為整體)、Ⅰ期、Ⅱ期的HCC患者分別進(jìn)行生存分析，circCDYL高表達(dá)患者總體生存率均低于低表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=52.06、30.65、15.49，P<0.05)；circCDYL高表達(dá)患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率均低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=38.24、28.13、7.63，P<0.05)；見(jiàn)圖3。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型探討影響HCC患者不良預(yù)后的暴露因素，發(fā)現(xiàn)circCDYL高表達(dá)是HCC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=22.712，P<0.05)，見(jiàn)表3。

注：A、D為對(duì)80例TNMⅠ～Ⅲ期HCC患者進(jìn)行的評(píng)估；B、E為對(duì)39例TNMⅡ期患者進(jìn)行的評(píng)估；E、F為對(duì)36例Ⅲ期患者進(jìn)行的評(píng)估。

表3 Cox回歸分析影響HCC患者預(yù)后的因素

續(xù)表3 影響HCC患者預(yù)后的暴露因素相關(guān)Cox回歸分析

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中circCDYL相對(duì)表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，這表明circCDYL可能參與了HCC的發(fā)生，其異常表達(dá)可能促進(jìn)肝臟正常上皮細(xì)胞過(guò)度增殖，其長(zhǎng)期作用會(huì)促進(jìn)腫瘤形成。腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移一般先侵襲上皮細(xì)胞基底面的附著層或微血管，再經(jīng)過(guò)淋巴循環(huán)或血循環(huán)形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此腫瘤細(xì)胞亞型是否具有侵襲性、有無(wú)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或血管浸潤(rùn)對(duì)預(yù)后判斷起到十分關(guān)鍵的作用[9-12]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：circCDYL表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部血管浸潤(rùn)有關(guān)；體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circCDYL能促進(jìn)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲，提示circCDYL可能有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用，同時(shí)circCDYL表達(dá)水平與患者TNM分期及復(fù)發(fā)情況也有關(guān)。TNM分期和復(fù)發(fā)是反映腫瘤進(jìn)展的重要指標(biāo)，TNM分期越高，患者預(yù)后往往不佳[13-14]，治療后腫瘤復(fù)發(fā)往往會(huì)導(dǎo)致患者的生存期大幅縮短，對(duì)患者的預(yù)后有十分不利的影響[15-16]，以上結(jié)果提示circCDYL與HCC的發(fā)展密切相關(guān)。circCDYL的表達(dá)與PD-L1和CTLA-4呈陽(yáng)性有關(guān)，PD-L1和CTLA-4是腫瘤逃脫免疫監(jiān)視和清除的重要分子，目前新興腫瘤治療的靶點(diǎn)多針對(duì)PD-L1和CTLA-4[17-18]，提示circCDYL可能通過(guò)促進(jìn)PD-L1和CTLA-4表達(dá)促進(jìn)HCC發(fā)生、發(fā)展，該推論需要進(jìn)一步的機(jī)制研究來(lái)驗(yàn)證。既往研究表明，circCDYL具有促進(jìn)套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖的功能[19]；但本研究發(fā)現(xiàn)circCDYL表達(dá)與腫瘤最大徑無(wú)關(guān)，推測(cè)circCDYL與HCC細(xì)胞增殖無(wú)關(guān)，這種差異可能由于組織特異性造成的。

本研究針對(duì)不同TNM分期的HCC患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)circCDYL高表達(dá)者的總體生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率均低于低表達(dá)者，同時(shí)多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)HCC組織中circCDYL高表達(dá)是促進(jìn)患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上結(jié)果提示circCDYL對(duì)HCC患者預(yù)后判斷可能具有一定價(jià)值，其高表達(dá)提示HCC患者預(yù)后不良。

綜上所述，circCDYL在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，其可能促進(jìn)了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲，后期仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。其高表達(dá)提示HCC患者預(yù)后不良，有望成為新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。