CRISPR/Cas技術在病原體檢測中的應用

陳逸凡 綜述，尹利民審校

1.昆明醫科大學，云南昆明 650000； 2.昆明市第一人民醫院檢驗科，云南昆明 650000

1987年在大腸埃希菌基因組中首次發現了成簇間隔短回文重復序列(CRISPR)，具有切割外來入侵病毒核酸的獲得性免疫功能[1]。CRISPR及其相關蛋白(CRISPR/Cas)系統是由編碼Cas蛋白基因和由啟動子加上重復序列與入侵核酸同源的間隔序列交替而構成[2]。該系統的獲得性免疫機制可以分為3個階段：獲得/適應、表達、干擾[3]。獲得階段，首次入侵的外來核酸被Cas1-Cas2復合物選擇并將其整合到CRISPR序列中，產生免疫記憶。隨后表達階段中外來核酸再次入侵，CRISPR序列被轉錄成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，再由Cas蛋白或以RNA為底物的RNA水解酶(RNases)進一步加工成短的成熟的CRISPR RNAs (crRNA)。最后的干擾階段，成熟的crRNA引導Cas蛋白進入外來核酸，在其與靶序列結合時，Cas蛋白識別靶序列上的原型間隔序列毗鄰基序(PAM)并切割入侵核酸[3]，例如Cas9和Cas12。Cas蛋白按照其功能可以分為兩大類(Class1、Class2)、六型、四十八個亞型[4]。Class1蛋白主要基于多亞基蛋白復合物負責采集病毒核酸，并產生免疫記憶，而Class2則是單效應蛋白，根據免疫記憶在guideRNA(gRNA)或crRNA引導下切割再次入侵的病毒核酸，從而抵御外源性病毒入侵[5]。Class2包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14，這4種Cas蛋白的性質見表1。其中Cas9作為強大的基因編輯工具被廣泛使用，其他則可應用于核酸檢測[6]。Cas12、Cas13和Cas14主要憑借它們的“附帶切割”能力進行核酸檢測，即在crRNA與靶序列結合后激活Cas蛋白，從而對非靶向的核酸片段進行切割使得檢測信號放大，達到檢測目的。

表1 Class2 Cas蛋白的性質

目前經常應用于臨床的病原體檢測方法多為基于聚合酶鏈反應(PCR)的分子檢測方法，但是在臨床實際應用中仍存在費用昂貴、對環境設備要求高、操作人員專業性要求高等問題。因此，開發出價格低廉、快速準確的病原體檢測方法，是當前病原體診斷的主要挑戰[7]。基于CRISPR/Cas的病原體檢測技術不斷發展，以其靈敏度和特異度高、可操作性強等優點，有望成為理想的病原體核酸檢測技術。

1 基于靶向DNA的CRISPR/Cas技術

1.1Cas12 Cas12a屬于Class2中的Ⅴ型蛋白，也被稱為Cpf1，在一個富含T PAM的crRNA引導下識別裂解雙鏈DNA(dsDNA)或單鏈DNA(ssDNA)[8]。而Cas12a有RuvC結構可以切割靶標和非靶標dsDNA[9]，與Cas13一樣具有“附帶切割”能力。2018年，CHEN等[10]利用LbCas12a與重組酶聚合酶擴增(RPA)技術結合開發出DETECTR平臺，成功在阿摩爾靈敏度水平快速檢測出人乳頭瘤病毒(HPV)16型和18型。該平臺不需要將擴增后的DNA產物再轉錄為RNA，因此，將檢測時間縮短到1 h內。同年，LI等[11]利用Cas12a的“附帶切割”能力識別并切割非靶向ssDNA，開發出HOLMES核酸檢測平臺，該平臺檢測乙腦病毒雖然具有較高的靈敏度和特異度，但其核酸擴增和靶向檢測是兩個獨立的步驟，增加了交叉污染的風險。次年，為改善這一問題，LI等[12]開發出了HOLMESv2平臺，將嗜熱蛋白Cas12b與環介導等溫擴增(LAMP)技術結合，實現了核酸擴增和靶向檢測一步化，從而達到簡化步驟、避免污染的目的。TENG等[13]同樣利用Cas12b開發出了CDetection平臺，研究表明該方法可以在1阿摩爾濃度人血漿中檢測出HPV DNA的存在，達到亞阿摩爾水平靈敏度和單堿基分辨特異度。WANG等[14]將RPA技術與Cas12a相互分隔集成到一個反應容器中，開發出Cas12aVDet可視化核酸檢測平臺，先進行RPA反應再加入Cas12a，從而實現一步式檢測，可檢測出細胞培養中的支原體污染。

除了與各種核酸擴增技術結合，CRISPR/Cas12還可以與各種傳感器相結合，進一步拓寬了CRISPR的應用。DAI等[15]開發出了一個基于Cas12a的電化學生物傳感器(E-CRISPR)，由于該平臺為Cas12a在體外反向裂解創造了優越的電化學環境，沒有任何酶擴增，所以在HPV16和細小病毒B19檢測中檢測限達到了皮摩爾水平。E-CRISPR有望成為精準、便攜的即時檢測診斷系統。

1.2Cas14 2018年有研究發現了Cas14蛋白，并將其作為DETECTR的一個輔助工具，開發出了Cas14-DETECTR[16]。Cas14蛋白由400～700個氨基酸組成，體積只有其他Cas蛋白的一半。它同Cas12、Cas13一樣具有“附帶切割”能力，能夠裂解ssDNA，且它不需要PAM激活。Cas14-DETECTR平臺可應用于高保真單核苷酸多態性(SNP)基因分型和高靈敏度單鏈DNA病原體檢測方法的研發，但目前還沒有用Cas14-DETECTR平臺進行檢測病原體的報道[6]。

2 基于靶向RNA的CRISPR/Cas技術

Cas13a屬于Class2中的Ⅵ型蛋白，也被稱為C2c2，只需要在crRNA的引導下靶向切割靶標單鏈RNA(ssRNA)或非靶標ssRNA[5]。研究表明，Cas13a還有雙重酶活性，能夠加工crRNA前體使其成為成熟的crRNA[17]。2017年，GOOTENBERG等[18]將Cas13a與RPA技術結合開發出了SHERLOCK核酸檢測系統。該系統原理是dsDNA通過RPA技術進行擴增，擴增后產物用T7聚合酶轉錄成靶ssRNA，ssRNA與crRNA互補配對，并激活Cas13a進行附帶切割報告基團，使其釋放熒光信號，見圖1。SHERLOCK在檢測寨卡病毒和登革熱病毒特異株中表現出較高的靈敏度和特異度，標志著CRISPR/Cas診斷技術的正式建立。為改善該系統缺乏量化、依賴熒光檢測設備讀取結果等局限性，進一步開發出了SHERLOCKv2[19]。首先，SHERLOCKv2同時運用LwaCas13a、CcaCas13b、AsCas12a、PsmCas13b實現四通道多重分析。根據不同crRNA與相應的Cas蛋白結合，切割不同的核酸，建立了4個顏色不同的熒光通道。其次，找到了合適的引物水平，并引入Csm6與Cas13耦聯，使靈敏度達到阿摩爾水平，檢測信號增強。最后，將結果讀取方式改為金標層析格式，將熒光素和淬滅劑換成FAM和生物素(biotin)。當報告RNA沒有被切割時，形成金納米顆粒-FAM抗體-FAM-RNA-biotin耦合物，只出現第一條線。而報告RNA被切割時，形成金納米顆粒-FAM抗體-FAM釋放，進一步出現第二條線。這種方式類似于人絨毛膜促性腺激素(HCG)早孕試紙，檢測方便、快速，有助于該系統在非醫院環境中的使用。2018年，HUDSON技術被發明[20]。HUDSON技術通過加熱法和化學還原法先滅活核酸酶再滅活病毒顆粒，從而使SHERLOCK可直接從患者體液標本中分析采集讀取信號。“HUDSON+SHERLOCK”的設計實現了所有反應均在一個容器內進行，不需要提取和純化，并且結果讀取使用熒光或金標均可。這對于病原體實現即時檢測有著重要意義。

圖1 SHERLOCK檢測原理示意圖

隨后，基于Cas13的病原體檢測方法的研究被大量報道。LIU等[21]利用LwCas13a的納米機制和便攜式熒光探測器成功快速檢出甲型禽流感病毒。QIN等[22]運用Cas13a識別并切割埃博拉病毒RNA后，引入微流控技術開發出了基于CRISPR的自動化多通路微流控檢測平臺。由于該平臺體積小，靈敏度高，沒有復雜的操作步驟，因此很適合用于埃博拉病毒流行、資源匱乏的發展中國家。ACKERMAN等[23]將微流體技術引入Cas13檢測系統開發出CARMEN-Cas13高通量多通路病原體檢測平臺。該平臺可同時檢測169種不同的人類相關病毒和十幾種人類免疫缺陷病毒耐藥突變株，靈敏度可達阿摩爾水平，與SHERLOCK和基于PCR的方法靈敏度相當。

3 基于靶向DNA或RNA的CRISPR/Cas技術

Cas9蛋白屬于Class2的Ⅱ型蛋白，在由反式激活crRNA(tracrRNA)和成熟crRNA整合形成的單向導RNA(sgRNA)引導下，識別靶dsDNA上的PAM并特異性切割dsDNA[24-25]。當靶ssDNA或ssRNA存在起PAM作用的寡核苷酸時，sgRNA/Cas9同樣可以切割ssDNA和ssRNA[7]。2016年，PARDEE等[26]將CRISPR/Cas9與核酸依賴性擴增檢測(NASBA)技術結合開發出了NASBACC平臺，這也是CRISPR/Cas技術在核酸檢測中的首次亮相，用于檢測非洲和美國寨卡病毒變異體，該平臺利用Cas9對寨卡病毒RNA經NABSA擴增并反轉錄而產生的dsDNA進行特異性切割，再通過紙基傳感器實現結果可視化判讀。該研究表明NASBACC平臺具有檢測基因突變的能力，可適應病毒的不斷變異[26]。HUANG等[27]利用Cas9切割和NEase介導的核酸擴增開發出一種新的CRISPR/Cas9觸發等溫指數擴增(CAS-EXPAR)反應，結合SYBR GREEN熒光顯色，用于快速、位點特異性核酸檢測。該平臺能夠在阿摩爾水平單堿基分辨率下成功在1 h內檢測出李斯特菌。

沒有切割活性的Cas9(dCas9)依然具有識別能力，同樣可應用于病原體檢測。2016年，ZHANG等[28]在成對的兩個dCas9上連接熒光素酶，分別位于一個dCas9的N端和另一個dCas9一半的C端。這對dCas9在sgRNA的引導下，識別并結合到靶DNA上下游，使熒光酶重組發出熒光信號。該方法在結核分枝桿菌的檢測中表現出良好的靈敏度及特異度。2017年，GUK等[29]采用CRISPR介導DNA-FISH方法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，該方法使用dCas9/sgRNA復合物作為靶向材料，SYBRGreenI(SGI)為熒光探針。由于不需要細胞裂解進行基因分離步驟，所以該方法可以在30 min內靈敏地檢測靶基因，而且通過改變sgRNA序列從而適用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以外的任何靶點。2019年，HAJIAN等[30]將CRISPR/Cas9與石墨烯場效應晶體管(gFET)技術結合，開發出了CRISPR-Chip平臺。該平臺將dCas9固定在石墨烯晶體管上，并與sgRNA形成dRNP復合物，識別結合靶序列并產生電化學信號。該方法不需要擴增技術，簡化了檢測使用的儀器和操作步驟。

4 總結與展望

上述基于CRISPR/Cas的病原體檢測方法，證明了該系統不僅是強大的基因編輯工具，還對病原體分子診斷方法的發展進步作出了巨大貢獻。截至2021年6月22日，全球報告新型冠狀病毒肺炎病例數量超過1.77億，死亡人數超過385萬[31]。實現COVID-19的快速準確診斷成為控制疫情的關鍵，但目前基于PCR的檢測方法的準確度和效率依賴于標本采集部位是否存在足夠數量的病毒，因此，急需開發出一種精確、快速、簡便的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)檢測方法[32]。研究表明，基于CRISPR/Cas方法在病原體核酸檢測方面表現出色，一定程度上可以彌補傳統PCR檢測方法的缺陷，有望成為理想的診斷方法[33]。AZHAR等[34]應用Cas9的同源物FnCas9開發了FELUDA平臺，該平臺擁有與金標準qRT-PCR相同的準確度，可廣泛應用于病原體的單核苷酸變體和核酸序列檢測。BROUGHTON等[35]將DETECTR與RT-LAMP技術結合開發出了一種快速可視化的實時RT-PCR替代方法，總用時只需30～40 min，檢測限低至10 copy/μL。JOUNG等[36]將SHERLOCK Cas12b同樣與LAMP結合開發出STOP平臺，用于SARS-CoV-2的檢測,被稱為STOPCovid。該平臺的優勢是不需要進行樣品提取,并且可以像HCG試紙一樣簡單可視化讀取結果，從而簡化流程，減少污染，精準檢測。在疫情暴發后，ACKERMAN等[23]在CARMEN-Cas13的冠狀病毒板中加入了SARS-CoV-2，該平臺用單個mChip可檢測400多份標本。這種可擴展的高通量多通路病原體檢測平臺極大地幫助了傳染性疾病的診斷和疫情的防控。

CRISPR/Cas系統在保證其靈敏度和特異度的同時，還具有不需要復雜的核酸提取、檢測時間短、易于操作、不需要昂貴的設備和專業的實驗環境等優點。盡管CRISPR/Cas系統在病原體檢測中表現優秀，但該系統仍然存在有待解決的問題：第一，脫靶效應可導致假陰性結果。脫靶效應指設計的sgRNA會與非靶點DNA序列錯配引起非預期的基因突變[37]。脫靶效應主要發生在基于Cas9的檢測方法中，通過優化sgRNA的設計和開發高保真的Cas9變體可以有效減少甚至避免脫靶效應。第二，識別靶位點依賴于PAM序列。不同的Cas蛋白識別不同的PAM序列，從而在增加檢測系統特異性的同時降低了sgRNA設計的靈活性，增加了實驗設計的難度。第三，大多數基于CRISPR/Cas的檢測方法都需要核酸擴增技術。有的結合RPA技術，有的運用LAMP技術，雖然較PCR技術簡單但是仍阻礙了即時檢測的實現。第四，sgRNA易被核酸酶縮短或降解。第五，目前大多數運用該系統的檢測方法還無法實現像SHERLOCKv2一樣的高通量多病原體檢測。

未來應進一步研究和發現更多適用于病原體分子診斷的新Cas蛋白，從而使CRISPR工具更加多樣化，同時也可以加入新材料或進一步優化信號放大系統真正實現一步化檢測。CRISPR/Cas系統還應進一步與其他技術平臺結合，如與計算機領域結合開發出適用于個人通信設備的軟件或系統，方便數據的儲存與及時上傳，從而步入完全的即時檢測時代。

總之，基于CRISPR/Cas系統的病原體檢測方法雖然存在著一些有待解決的問題，但憑借其方便、快速、準確等優勢，它仍然是目前最具潛力的病原體分子診斷工具。